Metoder for en gjær Tre hybridsystem

Metoder for en gjær Tre hybridsystem


Replikering av kromosomer, messenger RNA prosessering, oversettelse av proteiner og viktige beslutninger i tidlige stadier av utviklingen avhenger av samspillet mellom DNA, RNA og proteiner. Disse interaksjonene er de grunnleggende biologiske fremgangsmåter for gen-ekspresjon og proteinsyntese. Forskere bruker ofte Saccharomyces cerevisiae, de samme arter av gjær som brukes i bakervarer og brygging, for å studere de gener som koder for spesifikke proteiner og analysere interaksjonene mellom proteiner og andre molekyler. Gjær tre-hybrid systemet er en av tre varianter av gjær to-hybrid systemet brukes til å studere disse interaksjonene.

Two-hybridsystem

De to-hybrid metode blir brukt for å detektere protein-protein interaksjoner ved å se for ekspresjon av et reportergen. Mange proteiner har minst to domener, eller diskrete strukturelle og funksjonelle enheter. GAL4, et protein som finnes i Saccharomyces cerevisiae, har en DNA-bindende domene (DBD) og en aktiverings domene (AD). I denne fremgangsmåten blir en hybrid-protein fusjonert til DBD og en andre til AD. Ingen reportergen er uttrykt ved smelting av bare en av hybridene. Siden GAL4 reportergenet blir uttrykt bare når begge hybrider er til stede, er protein-protein interaksjon indikert.

The Three-hybridsystem

De tre-hybrid metode identifiserer et reportergen for å detektere interaksjonen av proteinet med RNA. Den første hybrid-proteinet består av en DBD kondensert direkte til et RNA-bindende domene. Den andre består av AD av transkripsjonsfaktor GAL4 knyttet til en RNA-bindende protein. RNA-bindende domener som samhandler med et hybridmolekyl av RNA som binder de to hybridproteiner for å danne et kompleks. Dannelsen av komplekset utløser ekspresjon av GAL4 reportergen. Siden reportergenet blir bare aktivert ved dannelsen av de tre hybridkompleks, indikerer dens tilstedeværelse interaksjonen av RNA og protein.

The One-hybridsystem

Den en-hybrid metode blir brukt for å detektere interaksjonen av proteinet med DNA. En ett-hybrid system sikringer et enkelt protein, som forbinder AD direkte til DBD. I stedet for å identifisere et reportergen, ser denne metoden for et spesifikt protein som må gjenkjenne en target DNA-sekvens. Tilstedeværelsen av det spesifikke proteinet viser interaksjonen av proteinet med DNA.

The One-Two hybridsystem

Den en-to hybrid metode brukes for å studere protein-protein og protein-DNA interaksjoner samtidig. Ved hjelp av nylig utviklede gjærstammer, anvender denne metoden GAL4 reportergen for å identifisere protein-protein interaksjoner og et p53-konsensus for å identifisere protein-DNA interaksjon. Fremgangsmåten er forventet å øke presisjonen av eksperimentelle resultater ved å redusere forekomsten av falske positiver oppnådd i andre hybridsystemer.