Bruken for Northern Blotting

Northern blotting ble utviklet av James Alwine og George Stark. Navnet "Northern" blot kommer fra en analogi til tidligere oppfunnet "Southern" blot oppfunnet av Edwin Sør. Mens en Southen blot måler DNA, oppdager en Northern blot RNA. Den er utført i flere trinn og kan anvendes for å sammenligne relative mengder av forskjellige former av RNA, registrerer størrelsen av et gitt RNA og lokalisere forskjellige former av et gitt RNA.

Utføre en Northern Blot

Northern blotting involverer flere trinn. Først blir RNA kjøres på en agarosegel som skiller den etter vekt. RNA blir deretter overført til et ark av mikrocellulose eller andre membran. Denne plate blir så inkubert med en sonde av enkelt-trådet DNA som er komplementær til RNA av interesse. Sonden vil binde seg til RNA. Selv sonder er usynlige, de er enten radioaktive eller bundet til et enzym for å tillate deg å visualisere dem senere. Dette gjør at du kan deretter direkte visualisere sonden og finn RNA av interesse.

Bestemme transkripsjon Size

Ved å kjøre RNA kjente størrelser ved siden av eksperimentell RNA, kan du bestemme størrelsen på RNA av interesse. Kontrollen RNA kalles en stige, og kommer vanligvis sammen med et fargestoff som gjør at det er synlig for det blotte øye når den kjøres på en gel. Andre stiger er radioaktivt, eller kan være farget med etidiumbromid for gjenkjenning. Sammenligning av plassering av RNA av interesse med stigen vil gi deg en følelse av molekylvekten.

Påvisning av alternative spleisevarianter

En riktig utformet sonde vil binde seg til alt RNA som er komplementært til det. Derfor, hvis vår RNA som finnes i flere former, sonden vil fremdeles binde seg til den. Disse ulike former, kjent som spleisevarianter, vises som egne band. Spleisevarianter oppstår når RNA-transkripter blir behandlet for å fjerne forskjellige regioner. Så lenge din strekning av komplementære nukleinsyrer har vært i avskrift, vil sonden binde.

Sammenligning av relativ transkripsjon Overflod

Hvis du har flere prøver, kan du direkte sammenligne hvor mye RNA av interesse er funnet i hver prøve ved å kjøre dem side ved side. Jo mer avskrift dag er mer sonden vil binde, og jo mørkere bandet vises ved deteksjon. På denne måten kan du få en følelse for hvor mye RNA i en prøve i forhold til en annen.