Faktorer som kan påvirke Overføring av Proteiner i Western blotting

Western blotting er en relativt enkel måte for å visualisere spesifikke proteiner fra cellelysat - blandingen av molekyler fra serie- eller "lyserte" celler. Ofte, men nybegynnere har dårlig hell med å få denne teknikken til å fungere ordentlig. En mulig feilkilde innebærer overføring av proteinene til nitrocellulose eller PVDF-membran ved elektroforetisk overføring.

Grunnleggende

Etter elektroforese blir polyakrylamidgelen fjernes fra buffertanken og proteinene det inneholder er overført til en nitrocellulose eller PVDF-membran. Den vanligste metoden for overføring av proteinene er den halvtørre metode. Ved denne metode blir et filterpapir og membran plassert på anode - en positivt ladet elektrode. Et annet stykke av filterpapir plasseres på toppen av gelen, etterfulgt av katoden. Proteinene har allerede blitt denaturert og er belagt med en forbindelse som kalles natriumdodecylsulfat, slik at de alle har negativ ladning. Følgelig er spenningsfallet mellom de to elektroder trekker proteinene ut av gelen og inn i membranen. Flere faktorer påvirker effektiviteten av denne overføringen.

Nåværende

Selv spenning og strøm er naturligvis relatert med Ohms lov (V = IR), er aktuell en viktigere enn spenningen i dette tilfellet. Hvis strømmen er for høy, kan det føre til overoppheting. Videre kan en høy strøm også føre til at mindre proteiner til å bevege seg så raskt at de ikke har en sjanse til å bindes til membranen. Velge en buffer som har en lavere ladningstetthet for å hindre strømmen fra å bli for høy; Tris-Glycine er et godt eksempel. Pass også på å DAB opp overflødig buffer liggende rundt filterpapiret / gel bunken. Bassenger eller sprut av buffer kunne koble elektrodene direkte, og skaper en kort.

Membran

Du kan kjøpe membraner med forskjellige pore størrelser; den størrelsen du velger, avhenger av størrelsen på proteinene du ønsker å studere. 0,45 mikrometer er et vanlig valg, selv om molekylvekten av protein er under 20 kD, trenger du kanskje en membran med en enda mindre porestørrelse. Også velge nøye når du bestemmer hva slags membran du ønsker. PVDF er dyrere enn nitrocellulose, men det er mindre sårbare, og du kan undersøke den flere ganger, mens nitrocellulose membraner kan vanligvis bare bli undersøkt en gang.

buffer~~POS=TRUNC Kjemikalier

Inkludert methanol i buffer er viktig, fordi den bidrar til å fjerne SDS fra proteiner, slik at de kan bindes til membranen. Legge for mye metanol, men fjerner SDS for tidlig, før proteinene har forlatt gel, noe som kan føre dem til å klumpe seg opp og bli fanget i gel. Avhengig av typen av eksperimentet og protokollen, er 20 prosent metanol en rimelig konsentrasjon, selv om det er viktig å inkludere en lav konsentrasjon av SDS i tillegg. Denne ekstra SDS bidrar til proteinene for å eluere, eller trekkes ut fra gelen.

Protein Charge og andre faktorer

Som metanol oppløser SDS, blir proteinene mindre negativt ladet. I noen situasjoner kan dette utgjøre et potensielt problem, fordi proteinene vandrer saktere som deres netto kostnad blir mindre negativ. Hvis du finner dine proteiner vil ikke ordentlig overføre på grunn av dette, kan du prøve en buffer med høyere pH, som CAPSO (3-N-cyclohexylamino-to-hydroxypropansulfonsyre), siden proteiner vil ha en mer negativ ladning på høyere pH. En annen faktor å vurdere er den tiden av overføringen; større proteiner bevege seg saktere, så du trenger for å gi tilstrekkelig tid for proteiner å overføre til membranen.