Funksjoner av en kloningsvektor

Funksjoner av en kloningsvektor


En kloningsvektor bærer fremmed deoksyribonukleinsyre (DNA) i en celle. Kloningsvektorer tillate replikasjon av lange eller unstudied gener. Forskere kan deretter opprette genomiske bibliotek og studere disse genene. Plasmider, fager, kosmider, bakterielle kunstige kromosomer (BAC) og gjær kunstige kromosomer (YAC) er eksempler på kloningsvektorer. Alle kloningsvektorer har egenskaper som gjør det mulig for deres replikasjon, celle valg og innsetting av DNA inn i dem.

DNA-sekvenser som tillater Replication

Alle kloningsvektorer har DNA-sekvenser som tillater vertsceller for å gjenskape dem. I bakterier, blir denne sekvens kalles et opprinnelsessted for replikasjon. Bakterie kunstige kromosomer har også Para og parB gensekvenser for å sikre hver dattercelle får en BAC under celledeling. Gjær bruk annet DNA-replikasjon maskiner enn bakterier. Derfor vektorer som er rettet mot gjær, som gjær kunstige kromosomer, krever sentromerer, telomerer og en autonom replikere sekvens.

Gener for valg

Funksjoner av en kloningsvektor

Bare bakterier med kloningsvektoren er i stand til å vokse.

Electroporation og visse kjemikalier sette hull i bakteriemembraner slik at kloningsvektor kan gå inn i bakterier. Bare en del av cellene tar opp vektoren. Derfor må vektoren for å kode for et markørgen. Markørgener gir mulighet for valg eller screening av celler. Antibiotikaresistensgener blir ofte brukt for valg. For eksempel bakterier som normalt ikke kan vokse på plater inneholdende ampicillin. Imidlertid beta-laktamase-genet tillater bakterier å bryte ned ampicillin. Når du kultur bakterier i nærvær av ampicillin, bare de bakterier som inneholder kloningsvektor med beta-laktamase-genet er i stand til å vokse.

Gener for Screening

Funksjoner av en kloningsvektor

Blå kolonier på en plate med ampicillin og X-gal inneholder en vektor, men ikke det innsatte DNA.

Bakterier som inneholder en tom vektor, og en vektor med det innsatte DNA både kan vokse i nærvær av et antibiotikum. Forskere bruke filtrering for å skille mellom disse kolonier. Blå-hvit screening er vanlig. Vektoren har DNA-innsetting områder i den kodende region av lacZ-genet, som koder for β-galaktosidase. Kolonier med funksjonell β-galaktosidase sving blå når de forbrenne x-gal. Når DNA settes inn i midten av LacZ-genet i vektoren, koloniene ikke lenger kan produsere funksjonelle β-galaktosidase, slik at de er hvite i farge. Derfor kan en forskere se på fargen av en koloni og vite om cellene i den bakterielle koloni inneholder den tomme vektoren eller vektoren med det innsatte DNA.

Restriksjonsenzymdigestion nettsteder

Funksjoner av en kloningsvektor

EcoRI gjenkjenner sekvensen GAATTC og kløyver DNA mellom G og A.

Restriksjonsendonukleaser er enzymer som gjenkjenner og kutte DNA på bestemte basepar sekvenser. En kloningsvektor må ha disse restriksjonsenzymseter for at DNA som skal innsettes i vektoren. Noen vektorer som inneholder en polylinker, er en sekvens av DNA som har flere restriksjonsenzymseter. For eksempel, er et plasmid som et sirkulært stykke av DNA og restriksjonsenzymer åpne sirkelen. Etter blanding av DNA-innskuddet med kuttet plasmid, blir DNA-ligase benyttes til lim, eller ligate, DNA sammen.