Gel elektroforese Cut & Paste Aktiviteter

Rekombinant DNA som inneholder DNA fra to eller flere kilder i kombinasjon for å danne et enkelt molekyl, og har mange anvendelser i et bredt spekter av aktiviteter. Forskere skape rekombinant DNA ved hjelp av "cut-og-lim" teknikker med enzymer som DNA ligase. Ofte er gelelektroforese ett av verktøyene som brukes til å analysere DNA i slike eksperimenter.

Klipp & Lim

Restriksjonsendonukleaser er en klasse av enzymer som gjør kutt i et DNA-molekyl. De binder til spesifikke sekvenser av baser i DNA kalles "restriksjonsseter." Type II restriksjonsenzymer lage et kutt på gjenkjenningssete, og er den mest brukte gruppen av restriksjonsenzymer. Når disse restriksjonsenzymer lage et kutt, de forlater en kort overheng som kalles en "sticky end" på en tråd av det spaltede DNA-molekylet. Ved å kutte en annen del av DNA de ønsker å sette inn med samme par restriksjonsenzymer, kan forskerne sikre at det vil ha matchende klebrige ender. Når DNA-fragmentene er blandet, vil de klebrige endene på innleggs paret opp med de klebrige endene på kløyvde opprinnelige molekylet; et enzym som kalles DNA ligase deretter "lim" klebrige endene sammen. I hovedsak tar denne prosessen et fragment av DNA og setter den inn i en annen DNA-molekyl på et punkt preget av restriksjonsseter for restriksjonsenzymer du bruker.

plasmider

Mange bakterier har små sirkulære biter av DNA atskilt fra sine kromosom; disse små sirkulære DNA-molekyler som kalles plasmider. Plasmider er gode bærere for innføring av gener i bakterier, enten for å fremstille et protein, eller for å lage kopier av DNA-fragmenter ved en teknikk som kalles klonings. Først blir DNA-fragmentet eller genet av interesse innføres i plasmidet ved hjelp av snitt-og-lime teknikk som er beskrevet ovenfor. Deretter blir plasmidet innføres i bakterien gjennom en av to enkle teknikker: chemoporation eller elektroporering. Endelig er de bakteriene dyrkes på det som kalles en selektiv mediet som kun bakterier som har tatt opp plasmidet kan overleve. Dyrke bakteriene gjør masse kopier av den opprinnelige plasmid, og dermed vår del av DNA.

Analyse med Gel elektroforese

I gel-elektroforese, blir DNA-prøver tilsettes til brønnene i en skive av agarosegel. DNA er negativt ladet, slik at når strøm tilføres, DNA reiser gjennom gelen mot den positive elektrode. Større stykker av DNA som beveger seg langsommere, slik at de vandrer DNA-molekylene bli separert på basis av størrelse. Når rekombinante DNA-er spaltet med restriksjonsenzymer (i hovedsak cut-og -paste enzymer), kan DNA-prøver tilsettes til gelen; de mindre fragmentene vil migrere foran de andre.

Restriction-Fragment Length Polymorphism Analysis

Å spalte en prøve av DNA med et restriksjonsenzym vil produsere et antall kortere fragmenter. Lengden av disse fragmentene kan variere mellom ulike individer, så gelelektroforese av restriksjons-spaltet DNA fra forskjellige individer kan gi et annet mønster. Denne type analyse ble ofte brukt i det siste for å kartlegge sykdommer arvet i familier; i dag, har det imidlertid blitt fortrengt av mer effektive metoder.