Hvordan å optimalisere Protein Expression

Hvordan å optimalisere Protein Expression


Proteinekspresjon er prosessen hvor informasjonen kodet i gener som er oversatt til et protein. I sine verter, er mange proteiner produseres i mengder som er for lavt for studier i laboratoriet. Derfor har forskere bruke forskjellige teknikker for å overuttrykker proteiner for å produsere en mengde som er tilstrekkelig nok for rensing og karakterisering. Gener av interesse blir satt inn i ekspresjonsvektorer (vanligvis fra pET-ekspresjonssystemet), som er DNA-molekyler som kan replikere uavhengig av kromosomal DNA. Disse vektorene blir deretter innført i en bakteriecelle, vanligvis en stamme av Escherichia coli, for vekst og overekspresjon. Hvis du er heldig, vil protein overuttrykker etter enkel overnatting vekst i et vekstmedium, men denne prosessen krever ofte feilsøking for å få optimale uttrykk nivåer.

Bruksanvisning

Optimalisere Vekst Tid og temperatur

1 Fremstille to eller flere fem milliliter (ml) kulturer av protein ved tilsetning av en bakteriekoloni fra en agarplate inneholdende protein i en 5 ml prøve av LB-medium. Grow kulturer over natten med risting ved 37 Celsius.

2 Legge til 500 mikroliter av hver natten kultur til en separat kultur inneholdende 50 ml LB neste morgen og plassere dem i et risteapparat ved 37 Celsius.

3 Tillat kulturer å vokse inntil absorbansen ved 600 nm når 0,6 (eksponentiell vekstfase). Mål absorbansen ved hjelp av et spektrofotometer Elementer med LB-medium. Når absorbansen når 0,6, tillate kulturer for å vokse til forskjellige tidspunkter. Foreslåtte tidspunkter er 3 timer, 6 timer, 12 timer, 18 timer og 24 timer.

4 Sjekk absorbansen etter hvert tidspunkt og lagre prøver av lik celletetthet for hver kultur i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Som en referanse, en absorbans på 1 ved 600 nm svarer typisk til en celletetthet på rundt 10 ^ 9 celler / ml. Juster hvor mye av hver prøve du lagrer i henhold til absorbans.

5 Gjenta trinnene ovenfor, men i stedet for å prøve forskjellige tidspunkter, prøve forskjellige temperatur ved å plassere 50 ml kulturer i Shakers av forskjellige temperaturer gang absorbans når 0,6. Foreslåtte temperaturer er 37 ° Celsius, 30 ° Celsius, 21 ° Celsius eller 18 ° Celsius. La det vokse for en tid som du selv velger. Gjenta innsamling av prøver som beskrevet i trinn 4.

Bruk av indusere

6 Forbered kulturer som beskrevet i punkt 1, trinn 1 og 2.

7 Legg IPTG til en sluttkonsentrasjon på 1 millimolar til en kultur når absorbansen ved 600 nm når 0,6. Den pET-ekspresjonssystem er kontrollert av lac-promoteren, som er det området hvor RNA-polymerase binder seg for å begynne gentranskripsjon. IPTG fortrenger lac-repressor, et protein DNA-bindende som bindes nær promoteren og hindrer RNA-polymerase vedlegg. Forskyvning av repressoren tillater binding av RNA-polymerase og gentranskripsjon.

8 Tilsett 5 prosent sukrose til en kultur etter absorbans har nådd 0,6. Sukrose er en karbonkilde for bakterievekst.

9 Legg både IPTG og sukrose til en tredje kultur. Du vil nå ha minst 4 kulturer: en med noe tilsatt til en kontroll, en med IPTG tilsatt, en med sukrose tilsatt, og en med begge IPTG og sukrose ble tilsatt.

10 Tillat kulturer å vokse for en tid og ved en temperatur som du selv velger og samle inn prøver som beskrevet i punkt 1, trinn 4.

Analyse av Expression Levels

11 Sentrifuger alle samlet prøver ved maksimal hastighet i en bordsentrifuge. Kast væske, slik pellet på bunnen av røret.

12 Suspender bakterielle pellets i en prosent OTG, et vaskemiddel som bryter ned celler.

1. 3 Kjør en SDS-PAGE gel analyse på alle innsamlede prøver og overvåke uttrykk nivåer av protein i hver prøve. Veksten tilstand som produserer mest protein uttrykk er det som du bør bruke for fullskala vekst, rensing og karakterisering av protein.

ytterligere optimalisering

14 Varier typer medier hvis uttrykket er fortsatt vanskelig. Alternative valg inkluderer Super buljong og Terrific buljong.

15 Varier bakteriecellestammer hvis uttrykket er fortsatt vanskelig. Vanlige stammer av E. coli som brukes for ekspresjon blir navngitt BL21 (DE3) og JM109 og er kjent for å overuttrykke proteiner brønnen.

16 Teste forskjellige kombinasjoner av vekst tid, temperatur og induksjon om nødvendig. Disse kan også bli testet i forskjellige vekstmedier og bakteriestammer.

Hint

  • Det kan være nødvendig å fortynne hver prøve lot absorbansen hvis verdiene er for høye for spektrofotometer for å måle nøyaktig. En tidobbelt fortynning anbefales ved å ta 100 mikroliter av din kultur og legge 900 mikroliter LB medium. Sørg for å ta høyde for fortynningsfaktoren når du lagrer prøver.
  • Bruk alltid personlig verneutstyr når du arbeider i et laboratorium. Dette inkluderer en laboratoriefrakk, vernebriller og hansker.