Hvordan analysere Elektroforese

I gel-elektroforese, blir prøver av DNA eller proteiner separeres - typisk basert på størrelse - ved å påføre et elektrisk felt som får dem til å migrere gjennom en gel. Bruk av gel elektroforese er rutine i biomedisinske forskningslaboratorier og brukes til å besvare en rekke forskjellige spørsmål, så det er egentlig ikke en universell måte å analysere resultatene. Ulike teknikker som Western-blotting, Northern-blotting og Southern blotting, for eksempel alle involverer gelelektroforese. Hvis du gjør agarosegel-elektroforese av DNA-prøver, den vanligste typen prosedyren, vil du vanligvis trenger å gjøre minst to ting: 1) skille uncut plasmider fra inserts, bretter plasmider og kutte plasmider og 2) anslå størrelsen av de forskjellige DNA-fragmenter. Slik fungerer det.

Bruksanvisning

1 Sjekk din lab notisbok å finne ut hvilke prøver ble lastet inn i hvilke baner. Når du har lagt brønnene for gel, bør du ha lagt merke til identiteten til hvert kjørefelt / prøve.

2 Bestem hvilken fil inneholder "ladder" av DNA-standarder. Disse er fragmenter av kjent lengde; deres migrasjon avstand kan brukes til å bestemme størrelsen av prøve fragmenter.

3 Ved hjelp av en linjal, måle avstanden på bildet inn fra brønnene i sporings fargestoff, noe som vil ha reist lenger enn noen av DNA-bånd (med andre ord, vil det være på bunnen av gelen). Spill dette tallet - enhetene du bruker er ikke viktig.

4 Mål avstanden på bildet fra brønnene til hver av bandene i "stigen", deretter dele denne avstanden etter avstanden som sporings fargestoff band. Denne beregningen gir deg den relative mobilitet for hvert bånd.

Eksempel: Anta at sporing fargestoff bandet reist 6 inches og vi har tre band som reiste 5, 4,5 og 3,5 inches. Hva er deres relative mobilitet?

Svar: Vi deler 5, 4,5 og 3,5 med 6 for å få relative mobilities av 0,833, 0,75 og 0,5833.

5 Skriv inn de relative mobilitet i regnearkprogrammet (Excel eller et annet lignende program som du bruker) sammen med størrelsen i kilobaser i hvert fragment i stigen. (Produsenten gir deg størrelsen på hvert fragment i stigene de leverer, så du bør allerede ha denne informasjonen.)

6 Grafen data med relativ mobilitet på x og størrelse i kilobaser på y.

7 Bruk Trendline-funksjonen på din regnearkprogram til å passe en ligning til dataene. Denne ligningen bør være en kraft ligning (f.eks x ^ -2), og bør passe dataene relativt godt (R-koeffisient på minst 0,9).

8 Se på bånd tilsvarende prøvene. Husk at mindre DNA-fragmenter reise lenger inn i gelen enn store DNA-fragmenter, slik at de nærmest sporende farvestoff vil være den minste. Vær imidlertid oppmerksom på at hvis plasmid (sirkulær) DNA er uncut, vil det bli "supercoil" eller vridd som en telefonledning, som faktisk vil føre til at det å reise lenger enn lineære DNA av samme størrelse. På samme måte vil en "nicked" plasmid som er blitt ufullstendig kuttet å reise en kortere avstand enn lineært DNA av samme størrelse. Derfor kan du ikke anslå størrelsen på uncut plasmider fra gel.

9 Match opp band i hvert kjørefelt med identiteten til den prøven du har lagt i det kjørefelt og avgjøre om det du ser er hva du ville ha forventet. Dette vil avhenge av eksperimentet. Generelt, men hvis du fordøyd et innstikk plasmidet med to restriksjonsenzymer, du forventer innsatsen vil bli frigjort fra plasmidet; siden det er mye mindre enn plasmidet, ville du forvente å se to band i at lane, en nær toppen og den andre ned nær bunnen. Et plasmid spaltet med bare en restriksjonsenzym bør danne bare et enkelt bånd som reiser litt lenger enn plasmidet kuttet med to restriksjonsenzymer, men ikke på langt nær så langt som til innsatsen.

10 Mål avstanden fra brønnene til kuttet plasmid og sett band med linjal. Del disse tallene etter avstanden som sporings fargestoff å finne relativ mobilitet av innstikk og kutt plasmider.

11 Plugg den relative mobiliteten av innstikk og kutt plasmider i ligningen regnearkprogrammet beregnet for deg. Denne beregningen skal gi deg et anslag på størrelsen på disse plasmider.

Hint

• Hvis du ser lyse, brede bånd i bunnen av hver enkelt kjørefelt, har du sannsynligvis noen RNA i gel - din renseprotokoll kan være feil.