Hvordan analysere Western Blot data

March 18 by admin

Western blot er en gel-elektroforese teknikk som analyserer proteininnholdet i en biologisk prøve. Denne teknikken er en standard prosedyre i biologiske forskningslaboratorier og kan også brukes i dataanalyse eller biomedisinske diagnose.

Western blot ta renset protein fra en vevsprøve og utsette den for en prosess som kalles SDS-PAGE, hvor proteinene blir separert ved vekt ved hjelp av en elektrisk strøm. Når proteinene ble separert, kan de overføres til en polyvinyldifluorid (PVDF) membran og analysert for forskjellige proteiner av interesse.

Bruksanvisning

Utvikle en Western Blot Gel for et protein av interesse

1 vaske PVDF membran i TBST løsning grundig. Plasser membranen i en rektangulær beholder fylt med TBST og plassere den på en tilt eller rotasjon rister ved lav hastighet (80-90 hertz) i 10 minutter. Dumpe TBST ut og gjenta denne vaske.

2 Vask membranen i blokkeringsbuffer. Forsiktig helle den TBST løsning ut og helle en ekvivalent mengde av blokkeringsbuffer inn i beholderen. Plasser beholderen på en ristemaskin ved lav hastighet i en time.

3 Bland opp din primære antistoff mens du venter på blokkering buffer for å fullføre. Sjekk antistoff for å se hva fortynning er anbefalt av produsenten og fortynne tilsvarende. For eksempel, hvis antistoffet må blandes i en 1: 5000 fortynning, kan du måle ut 10 ml blokkeringsbuffer og tilsett 2 mL (mikroliter) av primær antistoff.

4 Hell ut i blokkeringsbuffer og tilsett den primære antistoffløsning til beholderen. Den tid som er nødvendig for å inkubere det primære antistoff med en PVDF-membran, vil variere med antistoffet og vevsprøve. Den vanligste fremgangsmåten er å plassere membranen på en ristemaskin ved lav hastighet ved 4 ° C (i kjøleskap) for 16 til 18 timer. Din antistoff bør komme med en anbefalt inkubasjonstid.

5 Skyll PVDF membran. Hell den primære antistoff ut og skylle membranen i 10 minutter i TBST ved romtemperatur. Gjenta dette vasketrinn to eller tre ganger.

6 Inkuber membranen i sekundære antistoff. Den sekundære antistoff kommer med en anbefalt fortynning. For eksempel, hvis den anbefalte fortynning er 1: 10000, kan du legge til 1 mL til 10 ml blokkeringsbuffer. Sørg for at den sekundære antistoffet er merket "HRP-konjugert" fordi andre antistoffer ikke fungerer ordentlig med ECL kits.

7 Utvikle PVDF-membran ved bruk av ECL-kjemiluminescens, eller en tilsvarende system. Sjekk instruksjonene som følger med ECL kit for å se hvordan du skal blande utvikle løsningen, og hvordan du skal utvikle membranen.

Utvikle PVDF membran

8 Eksponere en film til membranen. Innen 10-15 minutter av ECL utvikling, bringe PVDF membran til et mørkerom. I stummende mørke, utsetter en blank film til membranen og legg den i mørkerommet er å utvikle maskin.

9 Når filmen kommer ut av utbygger, skru på lyset og se om filmen er tilstrekkelig utviklet. Hvis filmen er for lys, må du eksponere en ny film for en lengre tid. Hvis filmen er for mørkt, kan du prøve å utsette en annen film i ett minutt eller 30 sekunder.

10 Merk eksponeringstiden som skapte et godt utbygd film. Du kan bruke denne tiden for alle påfølgende kjøringer av denne prosedyren.

11 Skann utviklet filmen til en datamaskin ved hjelp av skanneren. Med de fleste skannere, kan du plassere filmen på skanneren og trykker på en knapp. Se dokumentasjonen som fulgte med skanneren for å finne ut om dette er den riktige fremgangsmåten. Når filmen er skannet inn, lagre bildet med et beskrivende filnavn som du vil være i stand til å gjenkjenne senere.

12 Åpne lagret bilde i ImageJ programmet. ImageJ er utviklet av National Institutes of Health (NIH), og er tilgjengelig gratis på nettet.

Sammenligne band på Utviklet Films

1. 3 Skaff en bakgrunn måling. Lag en rektangulær markering rundt det største bandet i Western blot med markeringsverktøyet (det første ikonet på verktøylinjen). Deretter flytter rektangelet til et tomt, ubebygd område av filmen. Hold nede Ctrl + M for å måle bakgrunnen mørket.

14 Flytt rektangel til første band på film og trykk Ctrl-M igjen. Gjenta dette i rekkefølge for alle band på film som du ønsker å analysere.

15 Kopier bandet data. Når du begynner å måle, vil en "Resultater" -vinduet vises. Når du er ferdig å måle, markere alle måledata og trykk Ctrl-C for å kopiere den. Åpne opp regnearkprogrammet og trykk Ctrl-V for å lime inn måledata. Nøye merke alle dataene som limes inn og lagre datafilen når du er ferdig å måle alle filmene.

16 Bestemme tettheten av hvert bånd. Verdien for din bakgrunn måling bør være det høyeste antallet siden det er lysere enn de skraverte band av din Western blot film. Trekk fra de bandet måleverdier fra bakgrunnen verdien til å bestemme deres relative tetthet. For eksempel, hvis din bakgrunnsverdi er 200 og du har fire band med lysstyrkeverdiene for 150, 170, 180 og 190, og de endelige verdiene for disse fire band er 50, 30, 20 og 10.

17 Sammenligne eksperimentelle grupper hjelp uansett statistisk analyse du ønsker å søke. De fleste forsøkene bruker en teknikk som kalles ANOVA (variansanalyse) for å sammenligne verdier på tvers av grupper. Mange statistiske pakker som PSAW har innebygd statistikk prosedyrer for å kjøre ANOVAs på riktig formaterte dataene.

Hint

  • Bland opp din blokkeringsbuffer umiddelbart før du begynner vasker. Blokkering buffer kan lett forurenset, og bare holder seg frisk i flere dager.
  • Sjekk alltid sikkerhetsdatabladet for å bestemme de riktige sikkerhetsprosedyrene ved håndtering av kjemikalier.
  • Utsett aldri uutviklet film for lys. Dette vil skade filmen.

Related Posts


Hvordan bruke Western Blot

Hvordan bruke Western Blot

Western blotting er en laboratorieteknikk for å detektere overflod av proteiner av interesse. Det er en nøyaktig metode som oftest brukt til å sammenligne protein nivåer av to prøver, en behandlet på en viss måte og en ubehandlet, og anvendt som en k
Hvordan bruke Restore Western Blot Stripping Buffer 21059

Hvordan bruke Restore Western Blot Stripping Buffer 21059

Western blotting er en bioteknologisk teknikk for påvisning av et spesifikt protein i en prøve. Det innebærer separering av proteiner ved størrelse og ladning ved hjelp av en fremgangsmåte som kalles gel-elektroforese; å overføre dem til en PVDF elle
Hvordan forberede Prøver for Western Blot

Hvordan forberede Prøver for Western Blot

Western blot er en teknikk som brukes i biokjemi å detektere de typer proteiner i en prøve. Proteinene separeres ved hjelp av gel-elektroforese og overført til en membran, hvor den blir probet med antistoffer. Antistoffene feste til proteinene på mem
Hvordan Block i Western Blot

Hvordan Block i Western Blot

Western blot kan påvise nærvær av spesifikke proteiner i en gitt prøve av vev-ekstrakt ved hjelp av gelelektroforese for å separere proteinene av polypeptidet lengde eller 3D-struktur. Etter at de forskjellige proteiner har blitt adskilt ved gelelekt
Hvordan Strip en Western Blot

Hvordan Strip en Western Blot

Western blot, eller protein immunoblot, er en prosedyre som detekterer tilstedeværelsen av spesifikke proteiner i en prøve. Overføring av proteiner til en membran etter elektroforese gir mulighet for påvisning av target-proteiner; antistoff-bundne en
Hvordan analysere Elektroforese

Hvordan analysere Elektroforese

I gel-elektroforese, blir prøver av DNA eller proteiner separeres - typisk basert på størrelse - ved å påføre et elektrisk felt som får dem til å migrere gjennom en gel. Bruk av gel elektroforese er rutine i biomedisinske forskningslaboratorier og br
Ulempene ved Western blotting

Ulempene ved Western blotting

Western blotting er en av de vanligste prosedyrer i biokjemiske laboratorier. I utgangspunktet, skiller den proteiner fra en prøve av størrelse, så tester ved anvendelse av antistoffer for å bestemme om et gitt protein som er til stede. Det er nyttig
Slik leser du en Western Blot

Slik leser du en Western Blot

Western blot er en type analytisk teknikk som kan anvendes eller forespurt av leger for å komme frem til en diagnose. Western blot virker ved å skille alle de forskjellige proteiner i en prøve, vanligvis en blodprøve. Når disse proteiner er blitt sep
Hva er Western Blot Brukes til?

Hva er Western Blot Brukes til?

Biomedisinske forskere og medisinske laboratorier finner det ofte nødvendig å bestemme om et gitt protein som er til stede i en prøve. Western blotting er en teknikk som gir en måte for å detektere tilstedeværelsen av et protein i en vevsprøve eller
Hva er Western Blot testen?

Hva er Western Blot testen?

Western blot testen, også kalt immunoblotting, er en test for et spesifikt protein i en proteinblanding. Western blot Testen utføres etter gel-elektroforese eller en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) test, og den bruker antistoffer for å identi
Faktorer som kan påvirke Overføring av Proteiner i Western blotting

Faktorer som kan påvirke Overføring av Proteiner i Western blotting

Western blotting er en relativt enkel måte for å visualisere spesifikke proteiner fra cellelysat - blandingen av molekyler fra serie- eller "lyserte" celler. Ofte, men nybegynnere har dårlig hell med å få denne teknikken til å fungere ordentlig.