Hvordan analysere Western Blot data
Western blot er en gel-elektroforese teknikk som analyserer proteininnholdet i en biologisk prøve. Denne teknikken er en standard prosedyre i biologiske forskningslaboratorier og kan også brukes i dataanalyse eller biomedisinske diagnose.
Western blot ta renset protein fra en vevsprøve og utsette den for en prosess som kalles SDS-PAGE, hvor proteinene blir separert ved vekt ved hjelp av en elektrisk strøm. Når proteinene ble separert, kan de overføres til en polyvinyldifluorid (PVDF) membran og analysert for forskjellige proteiner av interesse.
Bruksanvisning
Utvikle en Western Blot Gel for et protein av interesse
1 vaske PVDF membran i TBST løsning grundig. Plasser membranen i en rektangulær beholder fylt med TBST og plassere den på en tilt eller rotasjon rister ved lav hastighet (80-90 hertz) i 10 minutter. Dumpe TBST ut og gjenta denne vaske.
2 Vask membranen i blokkeringsbuffer. Forsiktig helle den TBST løsning ut og helle en ekvivalent mengde av blokkeringsbuffer inn i beholderen. Plasser beholderen på en ristemaskin ved lav hastighet i en time.
3 Bland opp din primære antistoff mens du venter på blokkering buffer for å fullføre. Sjekk antistoff for å se hva fortynning er anbefalt av produsenten og fortynne tilsvarende. For eksempel, hvis antistoffet må blandes i en 1: 5000 fortynning, kan du måle ut 10 ml blokkeringsbuffer og tilsett 2 mL (mikroliter) av primær antistoff.
4 Hell ut i blokkeringsbuffer og tilsett den primære antistoffløsning til beholderen. Den tid som er nødvendig for å inkubere det primære antistoff med en PVDF-membran, vil variere med antistoffet og vevsprøve. Den vanligste fremgangsmåten er å plassere membranen på en ristemaskin ved lav hastighet ved 4 ° C (i kjøleskap) for 16 til 18 timer. Din antistoff bør komme med en anbefalt inkubasjonstid.
5 Skyll PVDF membran. Hell den primære antistoff ut og skylle membranen i 10 minutter i TBST ved romtemperatur. Gjenta dette vasketrinn to eller tre ganger.
6 Inkuber membranen i sekundære antistoff. Den sekundære antistoff kommer med en anbefalt fortynning. For eksempel, hvis den anbefalte fortynning er 1: 10000, kan du legge til 1 mL til 10 ml blokkeringsbuffer. Sørg for at den sekundære antistoffet er merket "HRP-konjugert" fordi andre antistoffer ikke fungerer ordentlig med ECL kits.
7 Utvikle PVDF-membran ved bruk av ECL-kjemiluminescens, eller en tilsvarende system. Sjekk instruksjonene som følger med ECL kit for å se hvordan du skal blande utvikle løsningen, og hvordan du skal utvikle membranen.
Utvikle PVDF membran
8 Eksponere en film til membranen. Innen 10-15 minutter av ECL utvikling, bringe PVDF membran til et mørkerom. I stummende mørke, utsetter en blank film til membranen og legg den i mørkerommet er å utvikle maskin.
9 Når filmen kommer ut av utbygger, skru på lyset og se om filmen er tilstrekkelig utviklet. Hvis filmen er for lys, må du eksponere en ny film for en lengre tid. Hvis filmen er for mørkt, kan du prøve å utsette en annen film i ett minutt eller 30 sekunder.
10 Merk eksponeringstiden som skapte et godt utbygd film. Du kan bruke denne tiden for alle påfølgende kjøringer av denne prosedyren.
11 Skann utviklet filmen til en datamaskin ved hjelp av skanneren. Med de fleste skannere, kan du plassere filmen på skanneren og trykker på en knapp. Se dokumentasjonen som fulgte med skanneren for å finne ut om dette er den riktige fremgangsmåten. Når filmen er skannet inn, lagre bildet med et beskrivende filnavn som du vil være i stand til å gjenkjenne senere.
12 Åpne lagret bilde i ImageJ programmet. ImageJ er utviklet av National Institutes of Health (NIH), og er tilgjengelig gratis på nettet.
Sammenligne band på Utviklet Films
1. 3 Skaff en bakgrunn måling. Lag en rektangulær markering rundt det største bandet i Western blot med markeringsverktøyet (det første ikonet på verktøylinjen). Deretter flytter rektangelet til et tomt, ubebygd område av filmen. Hold nede Ctrl + M for å måle bakgrunnen mørket.
14 Flytt rektangel til første band på film og trykk Ctrl-M igjen. Gjenta dette i rekkefølge for alle band på film som du ønsker å analysere.
15 Kopier bandet data. Når du begynner å måle, vil en "Resultater" -vinduet vises. Når du er ferdig å måle, markere alle måledata og trykk Ctrl-C for å kopiere den. Åpne opp regnearkprogrammet og trykk Ctrl-V for å lime inn måledata. Nøye merke alle dataene som limes inn og lagre datafilen når du er ferdig å måle alle filmene.
16 Bestemme tettheten av hvert bånd. Verdien for din bakgrunn måling bør være det høyeste antallet siden det er lysere enn de skraverte band av din Western blot film. Trekk fra de bandet måleverdier fra bakgrunnen verdien til å bestemme deres relative tetthet. For eksempel, hvis din bakgrunnsverdi er 200 og du har fire band med lysstyrkeverdiene for 150, 170, 180 og 190, og de endelige verdiene for disse fire band er 50, 30, 20 og 10.
17 Sammenligne eksperimentelle grupper hjelp uansett statistisk analyse du ønsker å søke. De fleste forsøkene bruker en teknikk som kalles ANOVA (variansanalyse) for å sammenligne verdier på tvers av grupper. Mange statistiske pakker som PSAW har innebygd statistikk prosedyrer for å kjøre ANOVAs på riktig formaterte dataene.
Hint
- Bland opp din blokkeringsbuffer umiddelbart før du begynner vasker. Blokkering buffer kan lett forurenset, og bare holder seg frisk i flere dager.
- Sjekk alltid sikkerhetsdatabladet for å bestemme de riktige sikkerhetsprosedyrene ved håndtering av kjemikalier.
- Utsett aldri uutviklet film for lys. Dette vil skade filmen.