Hvordan beregne kcat

Hvordan beregne kcat


I kjemiske reaksjoner katalysert av et enzym, reduserer enzymmengden av aktiveringsenergien som kreves ved midlertidig binding med substratet og vri den inn i en anstrengt tilstand. K (katalysator) eller "kcat" for reaksjonen refererer til konsentrasjons-uavhengige konstant for den hastighet med hvilken et spesielt enzym kan forbrenne et substrat til et produkt molekyl. For å beregne kcat forskerne først blande flere reagensrør med varierende konsentrasjoner av substratet (kjent som en "enzymatisk assay") og teste dem i faste tidsintervaller med en lys spektrofotometer for å måle den økende konsentrasjoner av produktmolekyler. Denne informasjonen blir deretter plottet på en kurve og analysert.

Bruksanvisning

Beregning opprinnelige hastighetene

1 Plott et diagram av produktkonsentrasjon versus tid for data fra det enzymatiske analyse første reagensrør. Merk: den horisontale akse bør være "tid", og den vertikale akse skal være "produktkonsentrasjon".

2 Beregn den lineære regresjonslinjen for datapunktene du plottet i punkt 1, Trinn 1. Mens Excel og grafiske kalkulatorer kan lett finne ut dette lineære modellen, kan du utlede et estimat av regresjonslinjen helling ved å dele forskjellen i produktkonsentrasjon mellom tilstøtende data poeng ved deres forskjell i tid.

3 Registrere helningen av den lineære regresjonslinje fra del 1, trinn 2 som "initial reaksjonshastighet (Vo)." Merk: I regresjonslinjen modellen "[produktkonsentrasjon] = m [tid] + b," koeffisienten "m" er skråningen.

4 Gjenta trinn 1, 2 og 3 for resten av prøverørene i analysen.

beregning Vmax

5 Plotte den inverse av substrat-konsentrasjon for hvert reagensrør versus den inverse av den opprinnelige reaksjonshastighet (fra avsnitt 1, trinn 4). For eksempel, hvis den innledende hastighet for et reagensglass med en første substrat-konsentrasjon på 50 mikromolar (pM) var 80 pM / s, ville de inverse verdier være 1/50 uM for substratkonsentrasjonen og 1/80 uM / s for den innledende hastighet. Merk: de inverse substratkonsentrasjon bør være på den horisontale aksen og den inverse utgangshastighet skal være på den vertikale aksen.

Merk: substrat-konsentrasjonen bør være på den horisontale aksen, og initial reaksjonshastighet skal være på den vertikale aksen.

6 Bestem den lineære regresjonslinjen for diagrammet du plottet i punkt 2, trinn 1. Merk: fordi du trenger å vite y-kryss for regresjonslinjen, bør du legge inn punktene fra kapittel 2, trinn 1 i enten Excel eller et grafisk kalkulator og bruke den innebygde regresjon modellering funksjonalitet.

7 Dele en av y-skjærer fra den lineære regresjonslinjen. Dette vil gi deg verdien av den inverse av Vmax er den maksimale reaksjonshastigheten for enzymet. Merk: Hvis den lineære regresjonsmodellen tar form "[Inverse Vo] = m [. Inverse Underlag Kons] + b", da verdien av "b" vil være den y-kryss. Dividere en av "b" for å beregne den inverse av Vmax.

8 Del 1 av resultatet av § 2, trinn 3 for å beregne den faktiske verdien av Vmax.

9 Bestemme konsentrasjonen av enzymet i den opprinnelige analyse (se rådata). Merk: de enzymkonsentrasjon er den samme for alle prøverørene; bare de substratkonsentrasjoner variere i analysen.

10 Dele Vmax (fra del 2, trinn 4) ved hjelp av enzymkonsentrasjon (fra del 2, trinn 5). Resultatet er verdien av kcat.