Hvordan bruke GSH nivåer i Detecting ROS

Glutation, eller GSH, er en ikke-essensiell tripeptide laget av cystein, glutamat og glysin. Det er en kraftig antioksidant som beskytter celler og organer i kroppen din fra de skadelige effektene av ROS, eller reaktive oksygenforbindelser, som er dannet av molekylært oksygen som et resultat av ulike metabolske prosesser i kroppen. Antioksidanter, slik som glutation, nøytralisere den ROS og hindre dem fra å kommunisere med og skade på DNA og protein i cellene. Forholdet mellom oksidert og redusert form av GSH i kroppen din er et tegn på ROS-relaterte oksidativt stress i kroppen din.

Bruksanvisning

1 Tegn omtrent 2 ml blod ved venepunksjon i anticubetal venen med en 23-gauge nål sommerfugl festet til en 5 ml sprøyte. Tilsett prøven for å teste rør som inneholdt natrium-heparin, og sakte å vende røret for blanding.

2 Samle de røde blodcellene ved sentrifugering av prøven ved 2500 omdreininger pr minutt i fem minutter. Fryse og tine prøven tre ganger for å bryte cellene. Sentrifuger cellelysatet løsningen i 10 minutter ved 12.000 rpm og 4 grader, og samle supernatanten.

3 Fjerne protein fra prøven ved tilsetning av 5 prosent sulfosalisylsyre og sentrifugering av prøven ved 12.000 rpm i fem minutter ved 4 °. Oppbevar deproteinated supernatanten ved -112 grader.

4 Blande en tiol deteksjonsmiddel, GSH-reduktase, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat og analysebuffer i andeler som er angitt av settet produsenten for å gjøre det GSH reaksjonsblandingen. Mengden av hver kjemikalie avhenger av antall tester du har tenkt å utføre. Fortynn GSH reaksjonsblandingen i 5 prosent sulfosalisylsyre for å få konsentrasjoner på 16, 32, 63, 125, 250 og 500 mikroliter.

5 Legg til en til 10 mikroliter av det deproteinated blodprøven inn i brønnene i en mikroplate. Legg seriefortynnet GSH standard løsning, som er tilgjengelig i testsettet, til hver brønn for å bringe det totale volumet av hver brønn til 10 mikroliter.

6 Legg 90 mikroliter av GSH reaksjonsblanding som du gjorde i trinn 4 til hver brønn i mikro. Bland reagenset ved å riste på platen i 30 sekunder.

7 Mål absorbansen umiddelbart ved å plassere platen i henhold til lys med bølgelengder på 405 og 415 nanometer. Platen inkuberes i 30 minutter. Ta avlesninger etter hvert femte minutt om inkubasjon.

8 Fortynnet 6 millimolar av behandlede prøven med 5 prosent sulfosalisylsyre og trifluromethane sulfonat løsning. Dette vil fjerne all redusert GSH fra løsningen. Legg til en til 10 micoliters av denne løsning til brønnene i mikroplaten og gjenta trinnene 5, 6 og 7. Dette vil bidra til å estimere mengden av oksidert GSH i prøven.

9 Plotte absorbansverdiene og prøvekonsentrasjoner på en graf for å oppnå den GSH-kurven for både redusert og oksidert glutation. Beregn forholdet mellom begge former for GSH. Økte nivåer oksidativt GSH nivåer indikerer oksidativt stress og ROS.

Hint

  • Følg alle instruksjonene i produsentens kit og den tekniske håndboken nøye.
  • Ta nødvendige forholdsregler som hansker og briller når du bruker biologiske prøver.
  • Pass på at målingene er nøyaktige. Små variasjoner i GSH absorbans lesing kan endre resultatene av testen.