Hvordan bruke Western Blot

Hvordan bruke Western Blot


Western blotting er en laboratorieteknikk for å detektere overflod av proteiner av interesse. Det er en nøyaktig metode som oftest brukt til å sammenligne protein nivåer av to prøver, en behandlet på en viss måte og en ubehandlet, og anvendt som en kontroll. Påvisning av proteiner er basert på deres binding til spesifikke antistoffer, og derfor er effektivt for å sikre deteksjon av bare protein av interesse.

Bruksanvisning

Western Blot Protocol

1 Separate proteinprøver etter molekylvekt ved hjelp av gelelektroforese. Natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) blir mest brukt.

2 Sug blot papirer og nitrocellulose membraner i metanol og deretter flytte for å overføre buffer.

3 Overfør proteinene fra gelen til en nitrocellulosemembran ved å sette sammen en sandwich av en klatt papir, en nitrocellulosemembran, gel, og en annen blot papir i overførings cellen og snu overførings celle på den foreslåtte spenning. Proteinene blir overført fra gelen på membranen i den samme separasjons mønster.

4 Kast bort blot papirer og gel. Inkuber membranen med 5 prosent melk å binde klebrige områder på nitrocellulose som ville forstyrre påvisning av protein. Inkuber i minst en time. Melk er vanligvis oppløst i 1X Tris-bufret saltvann Tween-20 (TBST), men kan variere avhengig av protokollen.

5 Hell av melk og inkuber membranen over natten ved 4 ° C med et primært antistoff valgt til å binde til proteinet av interesse. Sjekk produktbladet for hvilken løsning å oppløse din antistoff i (vanligvis melk) og i hvilken konsentrasjon.

6 Vask membran med vaskebuffer minst 5 ganger i 5 minutter hver gang. Dette vil sikre en hvilken som helst ubundet primære antistoff vaskes av membranen slik at den ikke forstyrrer målingene. 1X TBST er et vanlig vaskebuffer.

7 Inkuber en membran av en time ved romtemperatur med et sekundært antistoff som gjenkjenner den primære antistoff. Sekundære antistoffer er identifisert av hvilke arter de samhandler med, for eksempel anti-mus eller anti-kanin. Velg den sekundære antistoff som matcher kilde arter av din primære antistoff. Sikre den sekundære antistoffet er konjugert til en pepperrotperoksidase enzym og sjekk med produsenten for å løse forhold og konsentrasjoner.

8 Vask membran med vaskebuffer på samme måte som ovenfor for å sørge for fjerning av eventuelt ubundet sekundært antistoff. Dette bidrar til å hindre bakgrunn støynivå.

9 Inkuber en membran med en forsterket kjemiluminescens (ECL) reagens i 5 minutter ved romtemperatur. ECL kits kommer med to komponenter, en luminalen komponent og en peroksidase komponent. Disse to er blandet sammen før tillegg til membran. Pepperrot peroksidase på bundet sekundært antistoff vil spalte luminalen fra ECL forårsaker membranen til å avgi lys der det sekundære antistoffet er bundet.

10 Forsegle membran i en plast ark deksel og tape i en filmkassett for utvikling.

11 Utsette membranen til en film i et mørkt rom og passerer det gjennom utbygger å visualisere signalet fra protein. Det er viktig å oppnå mørke nok bånd for å se proteinet, men ikke så mørkt at de er utvisket. Varier eksponeringstider for å få et klart signal.

12 Beregn den relative overflod av protein prøver ved hjelp av et program for å måle densitometry eller mørke hvert bånd.

Feilsøking Western Blot

1. 3 Rull over blot-membran-gel-blot sandwich med et glass pipette før du starter overføringen. Dette vil eliminere eventuelle luftbobler som vil forstyrre tilstrekkelig protein overføring.

14 Varierende konsentrasjonen av din primære antistoff hvis du får et svakt signal som ikke kan oppdages etter lange eksponeringstider. En høyere primær antistoff konsentrasjon vil fremme mer binding til protein.

15 Varier konsentrasjonen av den sekundære antistoff hvis det er en høy grad av bakgrunnsstøy på blot. En lavere sekundært antistoff konsentrasjon kan bidra til å redusere ikke-spesifikk binding.

16 Vaske membranen for lengre tid for å hjelpe til eliminering av bakgrunnsstøy.

17 Blokker med melk i mer enn en time hvis utviklet filmer inneholder mye bakgrunnsstøy. I tillegg kan normalt serum av det sekundære antistoff vertsdyr bli brukt til å blokkere.

Hint

  • Les alltid etikettene av eventuelle reagenser som brukes, og bruk og kast dem i henhold til spesifikasjonene. Bruk alltid personlig verneutstyr som hansker, labfrakk og vernebriller når du arbeider i laboratoriet.