Hvordan Design Grunning for Cloning

Primere er korte, syntetiske enkelt-trådede DNA-fragmenter som brukes for kloning. Polymerase-kjedereaksjon (PCR) som benyttes for kloning består av tre trinn: denaturerende (DNA av interesse blir delt opp i to separate tråder), annealing (primeren festes til genet av interesse) og forlengelse (DNA polymerase forlenger primeren for å klone DNA av interesse). God primer design er avgjørende for effektiv kloning. Det er mange faktorer å ta hensyn til ved utformingen av den optimale primer for genet av interesse.

Bruksanvisning

Faktorer å vurdere når du utformer Primere

1 Velg en del av basepar i begynnelsen og slutten av genet for forover og bakover primere. Hver primer vil være komplementær til den respektive seksjon. Husk at DNA syntetiseres fra 5 'enden til 3' enden, slik at 5 'forover primer må være komplementær til bunn strand, og din 3' reverse primer må være gratis til din topp strand.

2 Design primeren til å være 18-21 nukleotider i lengde. Dette bidrar til å hindre ikke-spesifikk binding av tennsatsen, slik at sekvensen som er komplementær med bare en del, men fremdeles inneholder nok lengde til å binde riktig.

3 Design primere for å ha en smeltetemperatur på 50-60 grader Celsius. En forenklet formel for å estimere smeltetemperaturen for en primer er T = 2 (A + T) + 4 (G + C).

4 Design primere så de inneholder 40-60 prosent av G og C nukleotider. Dette bidrar til å sikre at smeltetemperaturen er høy nok. Sikre at smeltetemperaturer av hver primer-par er innenfor 5 ° C av hverandre.

5 Unngå komplementaritet av to eller tre baser ved 3'-endene til primerne. Dette reduserer primer-dimerdannelse, som oppstår når primerne bindes til hverandre i stedet for til genet av interesse.

6 Design en GC klemme inn dine primere. Sette G og C-baser i løpet av de fem siste baser fra 3'-enden av hver primer. Dette bidrar til å fremme spesifikke binding ved 3'-enden. Dette skyldes sterkere binding av G og C baser. Unngå mer enn tre G eller C er i de fem siste baser i 3 'enden av hver primer.

7 Unngå å sette en T ved 3'-enden av primeren. Disse primere har en større mismatch toleranse.

8 Unngå påfølgende repetisjoner av 2 basepar (di-nukleotid repetisjoner), da dette kan føre til mispriming. Fire eller færre di-nukleotid gjentar er ideelle.

9 Unngå strekninger av en enkelt base, da dette kan også føre til mispriming. Unngå mer enn fire gjentatte baser på rad.