Hvordan finne pH Cytoplasm
Potensialet av hydrogen, eller pH-verdi, er et mål på surhet eller alkalitet av en væske. Det er viktig på mange felt, blant annet biologi, kjemi og miljølære. Måling av pH-verdien er enkel i de fleste situasjoner. Lakmuspapir kan settes inn i fluidet, og endring i fargen på papiret angir i hvilken grad væsken er syre eller base. I de tilfeller hvor fluidet som skal testes i en celle, andre metoder må utvikles.
Bruksanvisning
1 Avkjøl temperaturen i celleprøve til 41 til 50 grader Fahrenheit. Dette gir en bedre absorpsjonshastigheten av det fluorescerende materialet av cellene.
2 Installering av celleprøve med en fluorescens-induserende substans slik som BCECF. Dette gjøres ved å tilsette BCECF til cellemediet, og deretter omrøring av blandingen forsiktig i 2,5 timer. Den BCECF absorberes gjennom den permeable membran av cellene.
3 Separere cellene fra mediet, og en hvilken som helst ikke-absorbert BCECF ved å kjøre prøven gjennom en sentrifuge. Sett cellene i en egen beholder.
4 Varm opp celleprøve til 98,6 grader Fahrenheit i 30 minutter, for å approksimere forholdene i menneskekroppen. Hvis cellene som undersøkes som normalt lever på annen miljø enn det menneskelige legeme, justere prøven til passende temperatur.
5 Opphisse celleprøve ved å røre. Dette bidrar til å øke den fluoriserende aktivitet.
6 Måle fluorescerende intensitet av celleprøven ved hjelp av spektrofotometer. For best resultat, bruk eksitasjon lys på bølgelengder på 500 til 510 nanometer. Ved disse bølgelengdene, er det en større spredning av fluorescerende intensitet, slik at det er lettere å skille resultatene. Det fluorescerende intensitet blir målt i relative fluorescerende enheter (RFU), et forhold mellom lysstyrken av stoffet i en eksitert, fluorescerende tilstand til sin normale, umagnetisert tilstand. Jo høyere RFU, jo lysere stoffet, i forhold til normal tilstand.
7 Sammenligne spektrofotometrisk resultater til pre-tegnede kalibreringskurver. Generelt, desto høyere fluorescerende høyere pH i prøven. Med en eksitasjonsbølgelengde på 510 nm, vil et stoff med en pH på 6,4 viser en RFU på omtrent 20, mens et stoff med en pH på 9,9 ville vise en RFU på omtrent 55.
Hint
- 6-karboksyfluorescein er tilstrekkelig for å indusere fluorescens for større endringer i pH. BCECF er mer presist å bestemme små endringer i midten (6,5-7,4) pH-område.