Hvordan forberede cellelysater
Den viktig steg i å kjøre en vellykket protein analyse eksperiment forbereder en høy kvalitet cellelysat. Western blot er noen av de mest vanlige proteinanalyse eksperimenter utført i biologiske forskningslaboratorier, og cellelysat forberedelse er det første trinnet. Protein analyse og proteomikk tillate forskere å lære om funksjonene i proteiner gjennom biologiske systemer.
Bruksanvisning
1 Bruk hansker før håndtering noen av materialer eller utstyr.
2 Forbered lysis buffer ved å kombinere de ingrediensene som er oppført i "Ting du trenger." Juster pH-verdien i bufferen til 6,8 ved hjelp av saltsyre.
3 Chill lysis buffer. Hvis lysis buffer er utarbeidet en dag eller mer i forveien, chill det i kjøleskapet. Ellers chill det for en time på is.
4 Tilsett 1,5 ml av den suspenderte cellekultur i et 1,5 mL sentrifugerør.
5 Spin røret ved 3200 omdreininger per minutt (RPM) i 2 minutter i sentrifugen. Spinning vil føre til at celler til å danne en pellet i bunnen av røret. Cellekulturmediet bør være gjennomskinnelig ved slutten av sentrifugesyklus.
6 Kast supernatanten, være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten i bunnen av røret.
7 Resuspender pelleten i 150 ul lyseringsbuffer avkjølt. Dette bidrar til å oppløse pelleten av celler og begynner prosessen med å briste cellemembraner.
8 Legg glasskuler for å øke det totale volumet i røret til 0,3 ml. Kulene vil forårsake ytterligere aggregering av cellepelleten ved virvling.
9 Vortex røret på vortexer i full fart i 1 minutt.
10 Kjøle røret i 30 sekunder på is. Unngå å utsette røret for å varme temperaturer i lange perioder, da dette kan føre til proteinnedbrytingen.
11 Vortex røret igjen på full fart i 1 minutt.
12 Sentrifuger rør ved 2400 RPM for å trekke cellelysatet bestanddelene til en pellet i bunnen av røret.
1. 3 Oppbevares cellelysater i fryseren.