Hvordan forberede en hengende Drop

For å bestemme 3D-struktur av et protein, må du først en ren krystall av det. Den hengende dråpe-metoden bruker en dråpe av proteinholdige oppløsning hengende fra et dekkglass. Under denne hengende dråpe ligger et reservoar med en høyere saltkonsentrasjon enn den for dråpe. Over tid forlater vanndamp rulle og ender opp i reservoaret, slik at proteinet til å krystallisere. Hvert protein krever ulike forhold (for eksempel saltkonsentrasjon og pH), og ofte prøving og feiling tilbyr den eneste måten å finne de rette forholdene.

Bruksanvisning

1 Sett på lab utstyr (jakke, hansker og vernebriller).

2 Bruke en mikropipette for å legge til 1,1 ml av en natriumklorid (salt) og acetat-bufferløsning inn i et Eppendorf-rør.

3 Sentrifuger den lukkede Eppendorf-rør sammen med saltoppløsningen inne i det i omtrent fem minutter ved 13.000 rpm. Husk å balansere sentrifugen ved å plassere en annen Eppendorf-rør inneholdende 1,1 ml vann over fra og på motsatt side til saltoppløsningen røret.

4 Tilsett 1 ml saltoppløsning til en brønn i en 24-brønns plate.

5 Bruk fettfylt sprøyte for å plassere et tynt lag av fett rundt kanten av denne brønnen. Pass på å ikke legge for lite eller for mye. Hvis du legger for mye fett, vil fettet renne ned i brønnen og muligens ødelegge eksperimentet. Hvis du bruker for lite, vil vel ikke være lufttett og eksperimentet vil ikke fungere. Målet for akkurat nok fett som dekkglass og fett danner en lufttett forsegling senere.

6 Rull leire med hendene for å lage fire små baller, og presse dem på de fire hjørnene av 24-brønns plate. De vil fungere som støtte for å sikre dekselet til platen ikke kommer i kontakt med dekkglasset.

7 Bruk trykkluft til å blåse støv ut av dekkglass. Hold dekkglass med et par rene pinsett.

8 Suge opp 4 mikroliter lysozym-løsning med en mikropipette, og legge til denne løsning til midten av dekkglass. Endre pipettespisser, og legge til 4 mikroliter av saltløsning. Forsiktig pipettere opp og ned, suger inn fluidet og deretter å utvise den, for å blande saltoppløsningen med lysozym-løsningen. Vær nøye med å blande de to uten å spre væsken over hele dekkglass.

9 Snu dekkglass over raskt slik at væsken ikke sklir av, og plante det holdent på toppen av brønnen. Vær nøye med å trykke forsiktig på den slik at den danner en lufttett forsegling med fett rundt kantene av brønnen.

10 Skyv dekselet på 24-brønns plate på leire baller, og la platen på et kjølig sted.