Hvordan forberede Prøver for Western Blot

Western blot er en teknikk som brukes i biokjemi å detektere de typer proteiner i en prøve. Proteinene separeres ved hjelp av gel-elektroforese og overført til en membran, hvor den blir probet med antistoffer. Antistoffene feste til proteinene på membranen. Et fluorescerende kjemikalie blir deretter tilsatt til membranen, som reagerer med antistoffene slik at proteinene er synlige etter eksponering til film.

Bruksanvisning

1 Vask hendene og sette på latex eller nitrilhansker.

2 Fjerne cellevevet fra inkubasjonen kammeret. Plasser omtrent 1 gram av vevet i en morter. Tilsett nok flytende nitrogen til mørtel for å dekke vevet. Puss frosset vev med morteren før det er et pulver.

3 Legg pulveret til et reagensrør. Tilsett 10 ml lyseringsbuffer til reagensrøret. Bruke en polytron i 20 sekunders utbrudd til pulveret og væsken er homogene.

4 Cap reagensrøret og legg den i en sentrifuge. Kjør sentrifuger ved en 500 sentrifugalkraft ved 4 grader Celsius i 15 minutter. Fjern væsken på toppen av røret med en pipette og kast den.

5 Tilsett 5 ml lyseringsbuffer til pelleten i testrøret i 20 sekunder. Sentrifuger røret på nytt på samme tid og ved samme temperatur og styrke som i trinn 4. Fjern væsken på toppen av prøverøret. Tilsett 5 ml flere lyseringsbuffer og gjenta sentrifugen trinn.

6 Tilsett tilstrekkelig resuspendering buffer til prøverøret for å dekke pellet. Rist reagensrøret forsiktig for å blande pellet og buffer. Hell væsken i Eppendorf-rør og fryse prøvene ved negativ 80 grader Celsius.

Hint

• Unngå gjentatte tine-fryse-sykluser av prøvene, da det kan skade proteiner.