Hvordan isolere mRNA fra en celle

En celle genetiske blåkopi er kodet innenfor sitt genetiske materiale, eller DNA. Etter hvert som DNA aldri forlater kjernen i cellen, slik at denne informasjonen for å komme inn i cytoplasma hvor andre proteiner og biokjemiske komponenter befinner seg, er det nødvendig først å transkribere den DNA til budbringer RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Dette mRNA deretter blir oversatt til proteiner som utfører mange funksjoner i cellen. For å oppdage eller kvantifisere svært sjeldne mRNA, lage prober for mikromatriser eller bygge biblioteker med komplementære DNA-molekyler, må mRNA være isolert. Imidlertid total RNA (dvs. all RNA i en celle) ekstraksjon og påfølgende mRNA isolasjon er ikke gjensidig utelukkende prosesser; Den tidligere må utføres for at mRNA som skal ekstraheres.

Bruksanvisning

Isolering av mRNA fra total RNA

1 TRIzol homogenisering: Total RNA omfatter alle mRNA, transfer RNA, ribosomal RNA, og andre ikke-kodende RNA. For å skille disse fra andre cellulære komponenter, blir celle første briste åpen for å frigjøre innholdet. Dette gjøres ved å resuspendere cellene pelletert ved sentrifugering (sentrifugering ved høy hastighet) i TRIzol-reagens (Life Technologies). Andre versjoner av TRIzol (som Ambion Tri Reagens) fungerer på samme måte.

2 Total RNA Isolation: En serie av sentrifugeringer anvendes for å separere de forskjellige komponenter (proteiner, DNA, RNA) i cellen i lag, eller faser, i suspensjonen. Den øverste, gul-farget fase er sammensatt av fett og kan kastes. Den ønskede fase er farget rød, inneholder totalt RNA og er beholdt. Etter å ha utført et fenol-kloroform-ekstraksjon og en serie av alkoholvaskinger ved hjelp av isopropanol og etanol, kan RNA bli pelletert for mRNA-isolering. Legg RNase inhibitorer for å hindre at dette enzymet fra nedbrytning av total RNA.

3 mRNA Utvinning: Det er vanlig å bruke et kit for å isolere mRNA, som hjemmelaget lab protokoller ikke genererer store mengder av meget renset mRNA. Kommersielle kit inkluderer Invitrogen Fasttrack 2.0 eller Ambion sin Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Disse grunnleggende trinnene er felles for slike kits:

a) Bland RNase-hemmet lysis buffer i settet med opptil 300 mikroliter total RNA.

b) Varme i 5 minutter ved 65 grader Celsius og deretter umiddelbart avkjøle prøven på is i ett minutt.

c) Bland dette med 0,5 M natriumklorid og deretter helt oppløse Oligo dT (oligodeoxythymidylic acid) i dette utvalget.

d) Sentrifuge denne prøven og gjenvinne supernatanten, som vaskes flere ganger på en serie av binde og lave salt buffere levert i settene.

e) Eluer mRNA flere ganger til en kit-spesifisert volum (f.eks 500 mikroliter) oppnås.

f) utfelling av eluatet med natriumacetat og etanol utfelling. Re-suspendere i opp til 20 mikroliter dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet vann.

g) Oppbevares ved -80 grader Celsius og se etter kvalitet og kvantitet ved spektrofotometri.

Hint

• Hold alle reagenser, celler og RNA kaldt ved å senke i isen. Dette forhindrer at RNA fra å bli degradert av andre enzymer som blir frigjort ved homogenisering prosessen.
• Reagenser slik som TRIzol er giftige og må ikke komme i kontakt med hud eller slimhinner. Følg alltid trygge laboratorieprotokoller ved håndtering av dette reagenset.