Hvordan lage en kalibreringsstandard for en HPLC

Når det arbeides med høy ytelse væskekromatografi (HPLC), er god kalibrerings helt avgjørende for å sikre pålitelige, kvalitetsresultater. Riktig kalibrering av et HPLC-instrument begynner med å lage et passende kalibreringsstandard. I de fleste tilfeller krever kalibrering i virkeligheten en serie av standarder med økende konsentrasjon for å fremstille det som er kjent som en kalibreringskurve. Dette er en inntegnet linje og forbundet ligning som beskriver forholdet mellom konsentrasjonen av det kjemiske blir testet for, og responsen til HPLC-detektor.

Bruksanvisning

1 Bestemme kjemisk som man ønsker å teste for ved hjelp av HPLC (de "analytten"). For eksempel kan du ønsker å teste en rekke brus for fruktose innhold, og i så fall fruktose ville være analytten.

2 Oppnå en mengde av analytten kjemiske av passende renhet. Normalt renhet bør være over 99% og analytten bør kjøpes fra en pålitelig kjemiske forsyningsselskap. I tilfelle av fruktose, for eksempel, ville du kjøpe ren fruktose fra en kjemisk leverandør og ikke fra en matbutikk.

3 Bestem maksimums- og minimums forventet konsentrasjoner av analytten i prøvene du har tenkt å teste på HPLC. Når det gjelder brus, vil du undersøke etikettene på drinker og bestemme laveste og høyeste fruktose innhold blant de drikker du vil teste. Husk at den første prøven (brus) kan være fortynnet eller på annen måte manipuleres under forberedelse for analyse (avhengig av HPLC-metoden som brukes), og slik at analytt-konsentrasjonen i prøvene faktisk injisert på HPLC kan modifiseres. Det er den analytt-konsentrasjonen i prøvene som kjøres på HPLC som må tas i betraktning.

4 Bestem løsemiddel der du vil oppløse din analytten å gjøre opp kalibreringsstandarder. Dette løsningsmiddel må være i stand til på riktig måte å oppløse analytten over et forholdsvis bredt område av konsentrasjon (minst like høy som i prøvene man har til hensikt å teste). I tillegg bør denne oppløsningsmidlet ideelt sett være ganske lik den "mobile fase:" det løsningsmiddel som anvendes for å bære prøver via HPLC instrument.

5 Beregne mengden av analytt som kreves for å lage et "lager standard" løsning av analytten. Dette er funnet ved å multiplisere den nødvendige konsentrasjonen av lager standard ved det ønskede volum. Konsentrasjonen av analytten i denne oppløsningen bør være minst 10% høyere enn den høyest forventede prøvekonsentrasjon. Hvis den høyeste forventede fruktose konsentrasjon i en leskedrikk prøve er 8 g / 100 ml, og deretter lager standard kunne gjøres til en konsentrasjon på 10 g fruktose / 100 ml. En rimelig volum er 500 ml, og dermed 8/100 ml x 500 ml = 40 g fruktose ville være nødvendig.

6 Vei ut den nødvendige mengden av analytt til et passende nivå av presisjon. Ofte en vekt verdi i gram presise til ett eller to desimaler er egnet, men bedre presisjon kan være nødvendig for noen metoder.

7 Overfør den veide analytten til en volumetrisk kolbe på det nødvendige volum og tilsett den ønskede løsningsmiddel til fyll merket på kolben. Anvendelse av en volumetrisk flaske (heller enn en gradert begerglass, for eksempel) øker presisjonen av lager standard konsentrasjonsverdi. Slik at all analytt som er overført til kolben; bruke noe av løsningsmidlet for å vaske den i, om nødvendig.

8 Stopper i måleglasset, og rist eller invertere til analytten er helt oppløst.

9 Lag en rekke ulike fortynninger av lager standard ved å overføre kjente volumer i aksje standard inn Målekolbe, ved hjelp av pipetter for nøyaktig overføring, deretter legge løsemiddel. Det laveste standardkonsentrasjon bør være under den laveste forventede prøven som skal analyseres. I brus eksempel, hvis det lavest forventede fruktose-konsentrasjonen i en prøve er 2 g / 100 ml, deretter en 1 gram / 100 ml standard kunne gjøres. Dette vil bli gjort av en tidoblet fortynning av lager standard. Den standardserie bør inneholde en total av 5 eller 6 konsentrasjoner, slik at ytterligere fortynninger for å frembringe standarder for kanskje 3, 5 og 8 gram fruktose / ml ville være nødvendig. Du har nå en rekke standardløsninger som kan brukes til å kalibrere HPLC.

Hint

• Det er mulig å lage kalibreringsstandarder som inneholder mer enn en analytt hvis nødvendig.
• Det er ofte lurt å filtrere kalibreringsprøver (og standarder) før injisere dem inn på HPLC for å fjerne noen fine partikler som kan koble instrumentet.
• Noen standarder brytes ned raskt etter at de er gjort. Sørg for at dine standarder erstattes oftere hvis dette er tilfelle.
• Som med alle kjemiske prosedyrer, observere riktige forholdsregler når du arbeider med potensielt skadelige analytter eller løsemidler slik som de som er giftige eller brannfarlig.