Hvordan måle Indo-1 & GFP ved hjelp av flowcytometri

Strømningscytometri er den samtidige analyse av mange celler gjennom spesielle måleteknikker ved anvendelse av en anordning som kalles et strømningscytometer. Det er ofte brukt i biologisk og biomedisinsk forskning for å utføre komplekse analyser på store populasjoner av celler. Dette oppnås ved å føre en strøm av cellene gjennom en laserstråle og en rekke detektorer. Disse detektorene registrere lys gitt ut av fluorophores (fluorescerende molekyler) som GFP og Indo-en som visse proteiner er merket med før flowcytometri prosedyren.

GFP er vanligvis brukt for å måle ekspresjonen av innsatte gener (transgener) eller immunfluorescens koder mens Indo-1 brukes for å måle frigivelse av kalsium i cellen. Hvis begge forbindelser samtidig påført på cellepopulasjonen, kan man måle kalsium frigjøring i forhold til det uttrykte genet av interesse, og begge disse tiltakene i forhold til størrelse eller kompleksitet av cellen. Disse tiltakene er av potensiell interesse for diagnosticians og biomedisinske forskere.

Bruksanvisning

Analysere GFP og Indo-en i en celleprøve ved hjelp av flowcytometri

1 Påfør GFP til mobil befolkningen (e) ved hjelp biokjemiske teknikker. Du kan merke proteiner med GFP hjelp GFP-konjugerte antistoffer. Det er også ofte brukt sammen med transgene innsetting. Det kan også tilsettes gjennom viral vektor transfeksjon (for eksempel AAV eller lentivirus vektorer).

For å administrere en AAV virus, bare få en viral vektor fra en leverandør. Dette er vanskelig å gjøre, og kan bare opprettes i spesialiserte laboratorier. Bio-sikkerhet nivå 2 (BSL2) klaring er nødvendig for å arbeide med disse virusene. Microinject en liten mengde av vektor til vevet man ønsker å transfektere. Ved generell tommelfingerregel, vil en mikroliter transfektere en kubikkmillimeter av vev, men dette vil variere litt på tvers av ulike vevstyper og steder. Sjekk med leverandøren for å se hvor lenge å vente før transfeksjon er fullført. AAV vektorer vanligvis uttrykke i 2 til 4 uker.

2 Forbered strømningscytometeret for prøveopparbeidelse mens den indo-en er ruger. Den nøyaktige fremgangsmåten vil variere avhengig av merke og modell av cytometeret, men vil vanligvis innebære å slå på maskinen og legge slire væske til væske innspill tanken. Å analysere GFP og Indo-en, må du fluorescens filtrene til å analysere utslipp 405, 490 og 505 nm bølgelengde.

3 Laste opp analyse programvare som FCS Express. Naviger programmenyen for å velge prosjektprotokoll, data spare katalog og histogram-modus. Dette bestemmer hvor fort i prøve-strømningshastigheten er og hvor lenge det prøven er samlet på. En flowcytometer med en høyhastighets-sorter kan sortere flere tusen celler pr sekund. Strømningshastigheten kan variere fra 5 til 200 mikroliter per minutt, avhengig av modell. Hvis du er usikker på hva strømningshastighet er ideelt for ditt utstyr, lage flere testkjøringer før eksperimentet med umerkede celler, som starter på 5 mikroliter per minutt og en dobling av strømningshastigheten i påfølgende løper til du får en brukbar flyt eller nå 320 mikroliter per minutt .

4 Isolere omtrent 2 x 10 ^ 6 (to millioner) celler fra en cellepopulasjon og inkuber dem i Indo-1 i mørke i 30 minutter ved 37 grader Celsius.

Indo-1 kan administreres direkte til mobil befolkning når du har isolert den. For å gjøre dette, ta en cellesuspensjon og laste Indo-en inn i røret. Bringe den Indo-1 til en konsentrasjon på omkring 5 mikro molar (3,25 mikrogram per milliliter).

5 Vask cellene for å fjerne overskudd av indo-1 og resuspender celleløsning i cellelyse media (CLM). La cellesuspensjonen stabilisere seg i 45 minutter i mørket. For en suspensjon på ca 2 millioner celler, bør du bruke 2 milliliter CLM for en endelig konsentrasjon på en million celler per milliliter.

6 Injiser suspendert prøven i strømningscytometeret og start maskinen ved å begynne på "Acquire" fase i cytometri programvare. Celle data skal vises på en scatter-plot eller histogram på skjermen som data er ervervet.

7 Analysere dataene eller lagre data for senere analyse. For eksempel, vil histogrammet kunne fortelle deg om det er en sammenheng mellom GFP og Indo-en emisjon, og vil gi deg en skråning og korrelasjonskoeffisient som forteller deg graden og tillit korrelasjon.

Hint

• Hvis du vil legge til en ekstra dimensjon til analyse, kan du legge til en eksperimentell manipulasjon som en mobil aktivator. For å gjøre dette, først la noen celler går gjennom cytometeret for rundt 60 sekunder, og deretter legge til aktivator. Forholdet mellom 395-530 nanometer lys utslipp vil fortelle deg hva endre aktivator hadde på kalsiumkonsentrasjoner inne i cellen.
• For ideelle resultater, bør du kjøre positivt og negativt kontrollprøver. For å forberede en negativ kontroll for Indo-en, legger 8 millimolar EGTA (et kation chelator) til en cellesuspensjon før du legger Indo-en.
• Rådfør deg alltid med driftshåndboken for programvaren og maskinvaren før du implementerer denne prosedyren. Forskjellige typer utstyr har forskjellige standarder og toleranser. Innstilling strømningshastighet, flytende konsentrasjon eller detektor Spenningen er for høy kan skade utstyret.