Hvordan sette opp en enebolig Patch-Clamp Experiment

Den patch-clamp eksperiment blir brukt til å måle enkelt levende celler. Det gjør dette med en meget fin pipette holdes tett mot den enkelt celle membran (den ytre beskyttende dekke). Åpningen av denne pipette er bare omtrent en mikron (en tusendels millimeter) og styres optisk med et mikroskop. Celler holdes ensartet i en skål ved bruk av en celle detacher, slik som trypsin. En bestemt celle blir valgt og pipettespissen er plassert på cellemembranen. En tett forsegling dannes ved hjelp av sugekraft, og en del av membranen blir trukket inn i pipetten.

Bruksanvisning

1 Skaff en plate for celler. Vask platen to ganger med 10 ml PBS (fosfat-bufret saltoppløsning) uten kalsium og magnesium. Tilsett 2 ml detacher (trypsin). Inkuber platen i tre minutter ved 37 grader Celsius. Observer plate under mikroskop for å sikre at cellene har løsnet. Forsiktig bevege platen for å løsne alle celler fra bunnen av platen. Tilsett 10 ml HEK (human epidermal keratinocyctes) og FCS (føtalt ku serum) medium. Bruker en 10-ml pipette for å bevege cellene opp og ned.

2 Observere cellene under mikroskopet for å sikre at de er enkle celler. Pipetter med 10 milliliter pipette inntil cellene er enkelt, om nødvendig. Sentrifuger cellene i to minutter ved 1.000 omdreininger i minuttet. Kast supernatanten. Plassere cellene i 10 ml kalvefosterserum. Sentrifuger cellene igjen for to minutter ved 1.000 omdreininger i minuttet. Kast supernatanten. Plasser cellene i 200 mikroliter ekstern opptaksløsning. Observere cellene under mikroskopet for enkeltceller med en jevn membran.

3 Plasser saltvann inne i en patch clamp chip. Tilsett en dråpe intracellulære elektrolyttoppløsning til den nederste delen av brikken ved hjelp av en pipette. Monter chip på en vri cap. Det vri hetten skal inneholde referanseelektrode og sugeledningen. Tilsett en dråpe ekstracellulær elektrolyttoppløsning til toppen av brikken ved hjelp av en pipette. Elektrolyttoppløsningen gjør det mulig for prosessoren til å komme i kontakt med elektroden. Tilsett 5 ul cellesuspensjon til saltløsningen i brikken. Plasser en enkelt celle ved hjelp av sug gjennom en pipette. Suge kan utføres manuelt ved å suge luft gjennom pipetten. Plassering av cellen øker motstanden for å danne en tetning. Tetningen tillater undersøkelse av hele cellen.