Hvordan utvikle HPLC metoder

Hvordan utvikle HPLC metoder


High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er en av de mest brukte metoder for kjemisk analyse i det moderne analyselaboratorium. Utviklingen av en HPLC-metode er den mest kritiske del av enhver HPLC-analyse. HPLC-metoden er en definisjon av de kritiske parametre og prosesser som kreves for analyse av en bestemt kjemisk forbindelse. Uten en god metode resultatene som presenteres er verdiløs. Riktig valg av løsningsmiddel, kolonne og detektor er kritisk for oppnåelse av en brukbar analyse. Den viktigste delen av utviklingsprosessen er planlegging. Samle sammen grunnleggende informasjon om analytten (kjemisk forbindelse av interesse) bidrar i metodeutvikling prosessen. Selv om innsamling av grunnleggende informasjon vil ta tid, vil utbetalingen være i en raskere utvikling tid for den siste metoden. Uten god informasjon, gjøre deg dårlig valg om metodeutvikling prosessen.

Bruksanvisning

1 Søk i tilgjengelig litteratur for å se om det allerede finnes en fremgangsmåte for det samme analytten eller en veldig lik. Du bør undersøke kjemiske tidsskrifter og oppslagsverk av HPLC resulterer metoder for kjemisk av interesse. Prosessen med å utvikle en ny metode er tidkrevende. Det er mye mer effektivt å bruke tidligere utviklet metoden.

2 Utføre en oppløselighet studie på analytten eller en gruppe av analytter. Løselighetsegenskapene er viktige i å velge en kolonne materiale, til oppløsningsmidlet og bestemt måte å foreta HPLC.

3 Velg den beste stasjonære fasen eller kolonnemateriale som passer best til dine analytter. Den stasjonære fase er inneholdt i kolonnen som brukes i HPLC-analyse. Det er hovedkomponenten som skiller kjemiske forbindelser seg fra hverandre. kolonnepakning materiale er et silikabasert materiale som har bindingen funksjonelle grupper som vekselvirker med de kjemiske forbindelsene som de passerer gjennom kolonnen. Hvert kjemisk interagerer på en annen måte, og blir tiltrukket til den funksjonelle gruppe i varierende grad. Innen den ukjente prøve reiser lengden av kolonnen, vil kjemikalier som har meget lite tiltrekning til kolonnematerialet kommer ut først, etterfulgt av hver av de andre kjemikalier som utgjør prøven i størrelsesorden grader av interaction.The grad attraksjon for den stasjonære fasen (emballasje) vil veie tungt på bestemte materiale valgt.

4 Velge et oppløsningsmiddel for analysen. Løsningsmidlet må gi en viss løselighet til analytten og fungerer bra med den stasjonære fasen. Oppløsningsmidlet er et organisk eller polar væske som går gjennom hele systemet og transporterer den prøven som den flyter. Løsningsmidlet transporterer prøven gjennom systemet og hjelpemidler i separasjonsprosessen. Analytten samvirker med kolonnematerialet når det passerer gjennom kolonnen. Graden av interaksjon med kolonnematerialet fører til en separasjon av kjemikaliene fra hverandre. Av løsemidlene som bærer prøven gjennom kolonnen, fortsetter separasjonen finne sted mellom de kjemiske forbindelser i prøven, og ved slutten av kolonnen en enkelt bånd i løsningsmiddelstrømmen vil representere hver enkelt kjemisk forbindelse. Denne prosessen gir separasjon av analytter fra hverandre.

5 Bestem på effektiv kolonnelengden for å oppnå den grad av separasjon ønsket. Jo lengre kolonnen er, jo større separasjon. Typiske kolonnelengder er 50 cm, 100 cm, 150 cm og 250 cm.

6 Vurdere hvilke indre diameter av kolonnen er mest hensiktsmessig for din søknad. Den indre diameteren av kolonnen definerer den maksimale prøvestørrelse som kan håndteres av søylen uten å overbelaste kolonnen. Jo mindre den indre diameter, jo mindre oppløsningsmiddel er påkrevet for å kjøre analyse og den mindre prøven er nødvendig. Dette kan presentere store kostnadsbesparelser for et selskap som har til hensikt å kjøre metoden ofte.

7 Velg den beste detektoren for analytten. Det finnes et mangfold av detektorer tilgjengelig hver med sine egne spesielle egenskaper. Detektoren reagerer på de kjemiske forbindelser som er tilstede i oppløsningsmiddelstrømmen når den passerer ut av kolonnen på sin vei til avfallsbeholderen. Eksempler på typer av detektorer som er felles inkluderer fluorescens varslere, ultrafiolett / synlig spektrofotometre og brytningsindeks spektrometre. Avhengig av den informasjonen du ønsker fra analysen, bør du velge den detektoren som vil gi det.

8 Monter instrumentet de valgte egenskaper og begynne en studie som undersøkte den beste strømningshastighet og utvalgsstørrelse for å oppnå de resultatene du ønsker. Strømningshastigheten velges er den strømningshastighet som gir den raskeste resultater med den beste separasjon av kjemiske forbindelser. Som strømningshastigheten øker så gjør trykket i systemet, slik at du må gjøre avveininger for å oppnå den beste metoden. Noen ganger må du kjøre på en lavere strømningshastighet for å holde seg innenfor grensene av løsemiddelpumpen og jeg aksepterer den lengre analyse tid.

Hint

  • Bruk kun Spectro eller HPLC løsemidler. Trace urenheter kan konsentrere seg om kolonnen.
  • Velg bare et løsemiddel som ikke vil skade instrumentet eller kolonnemateriale.
  • Undersøke bare en variabel om gangen. Når du er ferdig med denne studien mener at variabel og begynne en studie endre den neste variabelen.