Hvordan velge kolonner i HPLC

En høy-ytelses væskekromatografi, eller HPLC, kolonne består av en metallsylinder fylt med små silikaperler som brukes for å separere forbindelsene i en blanding, for eksempel legemidler, hormoner eller proteiner. Den flytende blanding blir pumpet gjennom kolonnen ved hjelp av høyt trykk, noe som resulterer i hver komponent i blandingen som kommer ut ved forskjellige tidspunkter. Å velge den riktige kolonne basert på den type av forbindelse som man prøver å analysere er viktig for å oppnå optimale data.

Bruksanvisning

1 Silikaperler i kolonnen er porøse, og velge porestørrelsen avhenger av størrelsen av molekylene som blir separert. Små molekyler krever en porestørrelse på mindre enn 100 ångstrøm, og store molekyler, slik som proteiner, krever en porestørrelse som er større enn 300 Ångstrøm. En mindre porestørrelse vil øke kolonne ytelse, men vil generere mer systemtrykk.

2 Bestem lengden nødvendig kolonnen ved å bestemme hvor mange forbindelser og hva slags forbindelser du har til å skille seg. Søylelengder i området fra 5 til 25 centimeter. Lange kolonner gi bedre oppløsning og effektivitet, men krever lengre retensjonstider og høyere trykk. Det er å foretrekke å velge den korteste kolonnen mulig og samtidig beholde tilstrekkelig oppløsning.

3 Hvis oppløsningen er utilstrekkelig, vil redusere den innvendige diameteren av kolonnen hjelp. Mindre diameter vil øke effektiviteten og oppløsning, men det krever en lavere strømningshastighet for oppløsningsmiddel, og dermed øker tiden for analysen. Husk at eventuelle urenheter, for eksempel skitt, vil raskt tette opp kolonnen med små innvendige diameter.

4 Bestem størrelsen på silika perler du planlegger å bruke for kolonne din. De fleste kolonnene har en silikapartikkelstørrelse på 5 um. Mindre partikkelstørrelse, for eksempel 3 um, vil gi større separasjons og vil redusere analysetiden. Imidlertid mindre partikler krever en større mengde trykk for å presse blandingen gjennom kolonnen.

Hint

• Hver tilnærming i å velge en kolonne for analyse bærer en fordel og ulempe. Det er opp til brukeren å velge hvert aspekt nøye for å oppnå en optimal balanse i separasjons, effektivitet og trykket i systemet.