Komponenter av Lysis Buffer

Lyse er et ord som kommer fra gresk og betyr bare "å dele" eller "sprekker." Det er en god beskrivelse av hva som skjer med celler i en lyseringsbuffer, en løsning som bryter dem åpne for å trekke ut innholdet. Forskere bruk lysis buffer ved å ekstrahere DNA eller proteiner fra celler for analyse, særlig i tilfelle av bakterier. Typen av cellelyseringsbuffer, varierer avhengig av typen av eksperimentet, selv om det følgende er noen vanlige valg.

Buffer og Salt

Buffere stabilisere pH-verdien mens cellene blir lysert. Tris-HCL er en vanlig buffer for bufring ved pH 8; hvis pH er ønskelig, er en annen vanlig HEPES-buffer kjemisk i disse forsøkene. Natriumklorid salt kan også være inkludert for å heve ionestyrken, den totale konsentrasjon av oppløste stoffer utenfor cellene. Dette siste er viktig, siden vann kan diffundere over cellemembranen fra områder med lav konsentrasjon oppløst stoff til områder med høye oppløst stoff konsentrasjon.

Vaskemiddel

Vaskemiddel er nøkkelen ingrediens som løser opp cellemembranen slik at innholdet kan unnslippe. Vaskemidler er amfipatiske molekyler, dvs. molekyler med en ende som samhandler lett med vannmolekyler, mens den andre hydrofobe eller "vann-fryktet" end ikke. De kan oppløse fett ved å danne miceller, små klynger hvor de hydrofobe haler av vaskemiddel molekyler peker innover mot fettmolekylene. Vanlige vaskemidler inkluderer natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 og tritonX.

Chelatmidler og hemmere

Lysis buffere omfatter typisk også chelateringsmidler som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA). Disse kjemikaliene binder seg til metallioner med ladning 2 (som magnesium og kalsium), for derved å gjøre dem tilgjengelig for andre reaksjoner. Mange DNasene (proteiner som tygger opp DNA) og proteaser (proteiner som skjærer opp andre proteiner) trenger magnesiumioner til funksjon, så ved å frata dem denne nøkkelen ingrediens, EDTA og EGTA bidra til å redusere nivået av protease eller DNAse aktivitet. De trenger ikke utelukke det helt, imidlertid, og noen proteaser er ikke avhengig av magnesium kofaktorer, så lyse buffere noen ganger også omfatter kjemikalier som kalles proteasehemmere, som binder til proteaser og hindre dem fra å fungere ordentlig.

Alkaline Lysis

Alkalisk lysis er en meget vanlig teknikk for rensing av plasmider fra bakterier. Denne metoden innebærer tre løsninger. Den første inneholder glukose, tris-HCL buffer, EDTA og RNaser. Glukose skaper en høy oppløst stoff konsentrasjon utsiden av bakterier slik at de blir litt slapp, noe som gjør dem lettere å lysere; EDTA og tris-HCL funksjon som allerede beskrevet, mens den RNAse vil tygge opp en hvilken som helst RNA inne i cellen for å få den ut av veien. Den andre løsningen faktisk lyserer cellene. Denne inneholder en SDS vaskemiddel og NaOH, som hever pH-verdien til 12 eller høyere, denaturerende proteiner inne i cellen og forårsaker DNA for å separere i enkelttråder. Den tredje oppløsning inneholder kaliumacetat for å gjenopprette pH-verdien til et mer nøytralt nivå, slik at plasmidet DNA-trådene kan komme sammen igjen. I mellomtiden, de denaturerte proteiner klumper seg sammen og utfelles, mens dodecyl- sulfat-ioner kommer sammen med kaliumioner under dannelse av en uoppløselig forbindelse, som også utfelles fra oppløsning.