renaturering Protocol

Denaturering et protein, eller forstyrre dets native tredimensjonale struktur, er ofte uunngåelig i løpet av ekstrahere og isolere den fra andre cellulære komponenter. Siden en proteinets struktur er vanligvis er avgjørende for dets riktige funksjon, er det nødvendig å "renaturere» bretter eller et protein når det er isolert. Selv om egnede forhold for renaturering av et protein vil avhenge av faktorer som størrelse, løselighet og native konformasjon, noen generelle prinsipper gjelder i alle tilfeller.

Fjerne denaturering Agent

I alle tilfeller er det viktig å eliminere midlet som forårsaket proteinet til å utfolde seg i den første plass. Urea og guanidinhydroklorid er denatureringsmiddel, kjemikalier som bryter opp ikke-kovalente bindinger som de som stabiliserer en proteinets konformasjon og blir ofte tilsatt til denaturering løsninger. Disse små molekyler kan fjernes fra proteinoppløsningen ved dialyse eller kromatografi, eller i noen tilfeller kan konsentrasjonen av det denaturerende middel kan reduseres tilstrekkelig ved ganske enkelt å fortynne oppløsningen med frisk buffer.

Identifisere en Refolding Buffer

Med denaturant fjernet, kan proteinet igjen danner ikke-kovalente bindinger som stabiliserer dets tredimensjonale struktur. Dessverre kan de båndene som danner være forskjellig fra de opprinnelige, som resulterer i ulike konformasjoner eller i store samlinger av proteiner. Som denaturering agenten er fjernet, må proteinet støter på en buffer som gjen antar sin opprinnelige konformasjon er energisk foretrukket; dessverre, det er for øyeblikket ikke mulig å vite a priori som buffer oppskrift som passer for hvilke protein. I stedet blir en rekke buffere ofte vist i parallell, og den resulterende konformasjon i hver sammenlignet med den native struktur. Kommersielt tilgjengelige kits kan legge til rette for dette screening prosessen.

andre faktorer

Sannsynligheten for vellykket renaturering kan forbedres ved å observere visse tommelfingerregler. Fortynn proteinoppløsninger (10 til 100 mikrogram per milliliter) er mindre tilbøyelige til å aggregere på refolding enn mer konsentrerte oppløsninger. Temperaturen bør være kontrollert, og kan ofte faktor i prosessen som en parameter; lavere eller høyere temperaturer (i området fra fire til 37 grader Celsius) kan testes for sin virkning. Generelt reprodusere de betingelser under hvilke proteinet opprinnelig brettede er ofte nyttig, for eksempel, membranproteiner, som opprinnelig tok sin form, i nærvær av en lipid bilag, kan renaturert i en liposom-inneholdende løsning.