Slik feilsøker agarosegelelektroforese

DNA-fragmenter er ofte separeres basert på størrelse ved hjelp av en prosess som kalles agarosegelelektroforese. Fordi DNA er negativt ladet, vil DNA-fragmentene bevege seg i et elektrisk felt. Ved å laste en prøve som inneholder DNA-fragmenter i brønner i en skive av agarosegel og bruke et elektrisk felt, kan en forsker eller tekniker skille DNA-fragmenter, som mindre fragmenter vil bevege seg gjennom gel raskere enn store. Agarosegelelektroforese er mye brukt i DNA fingerprinting og DNA-sekvensering, men noen ganger er resultatene er utilfredsstillende, og fremgangsmåten krever feilsøking.

Bruksanvisning

1 Prøv å øke mengden av DNA du legge til brønnene hvis DNA-band er svak eller mangler. Konsentrasjonen kan være utilstrekkelig, eller mengden kan være for lite. Sørg imidlertid at mengden av DNA tilsatt per brønn ikke overstiger 50 nanogram. Det er også mulig at DNA var degradert; sjekk prosedyren du bruker for å rense eller forsterke DNA for å sørge for at du ikke forurense løsningen med nukleaser (enzymer som bryter ned DNA). Hvis du farving med etidiumbromid for å visualisere DNA, ved å bruke feil lyskilden kan også forårsake dette problem. Prøv å bruke en kort bølgelengde som 254 nanometer for en bedre lesing.

2 Prøv å sjekke spenningen du bruker hvis du oppdager at DNA-band mangler. Hvis du bruker for mye spenning eller electrophorese prøven for lenge, kan små DNA-fragmenter vandrer hele veien over skive og rett utenfor gel. Prøv å gjenta fremgangsmåten, men med en lavere spenning, eller for en kortere tidsperiode. Spenningen skal aldri overstige 20 volt per centimeter. Det er også mulig at du ikke gi nok tid for inngrepet, i så fall DNA-molekyler av lignende størrelse ikke kan separeres ved nok avstand at du kan løse dem klart. Prøv å gjenta prosedyren for et lengre tidsrom. Det er også mulig at du trenger en høyere prosentandel gel, noe som betyr en gel som har mer agarose og er dermed tykkere og mindre gjennomtrengelig. Sørge for at bufferen man bruker når blande gelen er den samme som den elektroforese buffer.

3 Prøv å redusere mengden av DNA du legger du merker bandene er utflytende. Det er også mulig det er for mye salt i DNA eller at prøven er forurenset med proteiner; sjekk prosedyren du bruker til å hente ut og rense DNA for elektroforese for å sørge for at du følger din lab protokoll. Sjekk også bufferkapasitet; hvis DNA i anode og katodekamrene har endret seg i løpet av prosedyren, kan du ha tilstrekkelig bufferkapasitet i elektroforese buffer. Høy temperatur eller for mye spenning kan også forårsake dette problemet; at temperaturen bør ikke overstige 30 ° C under denne prosedyren. Endelig kan små band av DNA har diffust i noen grad mens du var flekker å visualisere band. Hvis dette siste er problemet, kan du prøve å legge til etidiumbromid under elektroforese.

4 Agarosegelelektroforese har begrenset makt til å løse svært små fragmenter - de under 200 basepar. Hvis du trenger å skille svært små DNA-fragmenter, kan det være lurt å bruke polyakrylamidgelelektroforese stedet.