Slik feilsøker flowcytometrisystemer

Flowcytometri blir brukt til å kvantifisere celleegenskaper, for eksempel proteiner eller enzymer. Cellene ble farget med et fluorescerende flekk. Da en laser vil føre til at flekken fluorescerer. Det fluorescerende lys projiseres på en fluidstrøm, og lysspredning måles. Meget små partikler kan måles på denne måten. Det er flere problemer som kan skape problemer. De fleste av de problemer oppstår med prøven farging og forberedelse. Hvis du opplever mange problemer med selve maskinen da en tekniker må betjene flowcytometeret.

Bruksanvisning

svak Signal

1 Øke konsentrasjonen av stoffet du tester. Hvis det ikke er noe signal eller et meget svakt signal deretter en mulig årsak er at prøven ikke er konsentrert nok.

2 Kontroller at lasere i maskinen er riktig justert. Ta prøven og løp strømningssjekk perler gjennom maskinen. Juster lasere tilsvarende hvis de er ute av linjen.

3 Antistoffet eller prøven som måles kan ha blitt utelatt for lenge, og fluorescens har bleknet. Sminke frisk antistoff og prøv igjen.

4 Gjenta prosedyren på fire grader Celsius. Målproteinet av interesse kan være intracellulær og reaksjoner ble utført på feil temperatur. Ved hjelp av kalde reagenser vil sikre at alle reaksjoner toppen når det er nødvendig. Tilsetning av natriumazid til oppløsningen kan også bidra til å opprettholde intensiteten av fluorescens.

høy Bakgrunn

5 Sjekk at cellene ikke har brutt opp. Ødelagte celler vil frigjøre interne objektene, og disse vil bli plukket opp av cytometeret skape en høy bakgrunn lesing. Unngå å bruke gamle celler og løsninger som gamle celler bryte som de gamle.

6 Utgjør en ny løsning og slå ned farten av virvelen og sentrifugen. Sentrifugering ved høye omdreininger per minutt eller høye virvling hastigheter vil føre celler til å bryte åpne.

7 Se på din prøven under et mikroskop og sørge for at prøven ikke er forurenset. Bakterier i prøven vil skape et høyt bakgrunnsnivå.

begivenheter

8 Bland forsiktig cellene før du kjører gjennom cytometeret. En lav konsentrasjon av celler pr milliliter vil resultere i en lav frekvens av hendelser. En cytometer Prøven må inneholde en million celler per milliliter.

9 Pipetter prøven flere ganger for å bryte opp noen klumper av celler. Klumper vil blokkere røret og kan føre til en lav frekvens av hendelser. Pipettering før farging av cellene vil sikre at klumpene ikke danner.

10 Fortynne prøven hvis du får en høy frekvens av hendelser. Prøven må inneholde mellom 100 000 og en million celler per milliliter.

høy Fluorescence

11 Redusere mengden av antistoff som brukes. Høy fluorescens kan være forårsaket av ikke-spesifikk antistoffbinding. Du må kanskje gjøre flere forskjellige reduksjoner for å oppnå den ønskede fluorescerende intensitet.

12 Sikre dine vasketrinnene er lange nok og bruker nok vaskeløsning. Hvis du utfører intracellulær farging deretter overskytende antistoff kan bli fanget og blir ikke vasket bort. Pass på at vasketrinnet er riktige. Sminke friske vaskeløsninger.

1. 3 Sett inn en blokkeringstrinn i prosedyren. Denne blokkerende middel tilsettes til prøven med antistoffet. Styrken av det blokkerende middel bør være en til tre prosent. Den blokkerende middel vil stoppe antistoff fra binding til steder det ikke burde.