Slik feilsøker Isoterm Titrering kalorimetri
Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) er en teknikk for å få informasjon om reaksjonen mellom to molekyler. En oppløsning av en biomolekyl blir injisert flere ganger i en løsning inneholdende dets bindingspartner. Varmen som absorberes eller frigjøres under reaksjonen blir overvåket ved å registrere hvor mye energi ITC maskinen bruker for å holde reaksjonsoppløsningen ved en referansetemperatur. ITC-avlesning frembringer topper som tilsvarer hver injeksjon og disse kan integreres for å måle mengden av varme som oppstår ved reaksjonen, som er direkte korrelert til bindingsaffinitet til de to molekyler.
Bruksanvisning
Klar Eksperimenter for å unngå dårlige data
1 ITC Maskinen inneholder en referansecelle som er fylt med vann eller buffer for å tilveiebringe referansetemperaturen og en reaksjonscelle som inneholder et molekyl som skal studeres. En buffer er en løsning i stand til å opprettholde den samme pH (surhetsgrad) når små mengder av forbindelser tilsettes til det. Oppløs hver bindingspartner i den samme buffer. En pH-meter måler nøyaktig pH. Kontroller pH-verdien av reaksjons løsninger for å sikre at de er så nær som mulig. Dette vil eliminere bakgrunnsstøy som kan forstyrre eller forkledning topper i avlesning.
2 Degas alle prøvene før du legger dem til ITC maskinen. Dette vil redusere luftbobler og hjelp kontroll bakgrunnsstøy eller ekstra topper i ITC avlesning.
3 Sett på injeksjonssprøyten når det er bøyd. Denne sprøyte blir brukt til å injisere et molekyl inn i cellen inneholdende dets bindingspartner.
4 Legge til et tilstrekkelig nivå av væske i referansecellen for å sikre at basislinjenivå av avlesningen ikke er for høy. Fullt oppløse buffere før du legger dem til cellen for å hindre en lav baseline nivå.
Feilsøking Uklare data
5 Teste forskjellige konsentrasjoner av begge molekyler for å finne de optimale reaksjonsbetingelser for reaksjonen. En 1: 1 molart forhold bør være nådd etter påfølgende injeksjoner.
6 Øke tiden mellom injeksjonene hvis grunnlinjen ser ut til å være i drift. Grunnlinjen skal være stabil.
7 Øk referansen motregnes dersom energi målingene er under null.
8 Endre temperaturen av forsøket med 5 til 10 grader Celsius til store nok topper observeres dersom det ikke oppdages noe energinivå. Reaksjonen blir klassifisert som svak eller ikke-eksisterende dersom ingen energinivå blir detektert etter justering av temperaturen.
Riktig Clean Up Sikrer gode data
9 Vask injeksjonssprøyten grundig med mer enn 50 ml vann etter fullføring av eksperimenter. Dette vil sikre at intet bunnfall i sprøyten og griper inn i neste eksperiment.
10 Vask prøvecellen grundig med vann ved hjelp av en lang nål sprøyte. Dette vil hindre gamle prøver fra utfelles i cellen, og å forstyrre den neste eksperiment.
11 Vask prøven celle med en cleanser kompatibel med maskinen. Sjekk bruksanvisningen for en liste over kompatible rensemidler.