Slik kalibrerer HPLC kolonner

Slik kalibrerer HPLC kolonner


Væskekromatografi (HPLC) har en rekke anvendelser i laboratorieanalyse. Som et forspill til å utføre en faktisk analyse, er det viktig å kalibrere et HPLC-system, inkludert kromatografisk kolonne, som frembringer separasjon av kjemiske analytter. Kalibrering sikrer at forskjellige analytter som kan identifiseres ved sin oppholdstid i kolonnen, så vel som kvantifisert i henhold til størrelsen av deres detektorresponsen.

Bruksanvisning

HPLC kolonne Kalibrering

1 Bestem deg for HPLC-metoden parametere der vil du kalibrere kolonnen. Disse vil inkludere faktorer slik som den bestemte mobilfaseløsningsmiddel som anvendes, oppløsningsmidlet strømningshastighet, typen av detektorsystemet og detektorinnstillingene, så vel som den kjemiske vil bli testet for (analytten). Ofte en eksisterende metode kan anvendes, slik som en spesifisert av et reguleringslegeme (Environmental Protection Agency, for eksempel).

2 Forbered en rekke standardkalibreringsløsninger. Disse vil bli fremstilt ved oppløsning av økende mengder av analytten kjemisk i et egnet oppløsningsmiddel. Løsningsmidlet vil bli spesifisert ved fremgangsmåten, eller ofte det samme løsningsmiddel anvendt for den mobile fasen kan arbeide for å oppløse analytten. En typisk kalibreringssett ville bestå av fem eller seks løsninger, som spenner over et område av konsentrasjoner fra null til 100 deler pr million.

3 Slå på HPLC og dets tilknyttede komponenter, så som mobilfase pumpe, detektor og datafangst datamaskin.

4 Koble kolonnen innløpet til løsemiddelpumpen utgangsledningen og koble kolonne utløp den til detektoren linjeinngang.

5 Start pumpen for å starte strømmen av den mobile fase gjennom kolonnen med en hastighet som er angitt ved fremgangsmåten. I fravær av en standard metode, er en strømningshastighet på 1 til 2 milliliter per minutt vanlig.

6 Injisere hver standard analytt-løsningen inn i HPLC, en om gangen, fra laveste til høyeste konsentrasjon. Metoden skal angi volum å injisere, eller et typisk volum på 20 til 50 mikroliter, kan anvendes.

7 For hver injeksjon, observere detektorutgangen spor på datainnsamling datamaskinen. Når detektorutgangen viser en tydelig topp i respons på analytten som forlater kolonnen og som passerer gjennom detektoren, stoppe datainnsamling, lagrer datafilen elektronisk, og injisere den neste prøven.

8 Etter at alle prøvene ble injisert og en detektorresponsen datafil er lagret for hver, bruk datainnsamlings- programvare for å integrere toppene for hver fil for å bestemme oppholdstiden for analytten og topparealet for hver injeksjon.

9 Sammenlign tilbakeholdelsestider for alle injeksjoner for å sikre at de er alle i rimelig nærhet av hverandre (innen ca. pluss eller minus fem prosent). Registrere dette som oppholdstiden for den analytten på den kolonnen for å hjelpe til fremtidig analyse av ukjente prøver.

10 Bruke datainnsamling programvare, eller et program som Excel, inn en serie av datapunkter som består av standardløsning analyttkonsentrasjoner og tilsvarende topparealene. Har programvare for å generere en lineær ligning som gjelder de to i form av: topparealet = (m) (Konsentrasjon) + b, hvor m er helningen og b skjæringspunktet. Dette er kalibreringsligningen for den analytten på den kolonnen.

Hint

  • Legg merke til at kalibreringen utføres her er også avhengig av den tilhørende HPLC-instrumentering, slik som detektoren og pumpen. Hvis kolonnen er flyttet til en annen HPLC, eller hvis tilstander som løsningsmiddel strømningshastighet endres, kalibrering bør gjentas.
  • Tilbakeholdelsestider kan endres over tid på grunn av ulike faktorer som kolonne slitasje. HPLC bør kalibreres ofte selv om ingen endringer er gjort til instrumentet eller metode.