Slik leser agarosegel
Når du har kjørt DNA-prøver på en agarosegel og tatt et bilde, kan du lagre bildet for senere, og da kan du analysere resultatene og tolke dem. Den slags ting du leter etter vil avhenge av eksperimentet. Hvis du gjør DNA fingerprinting, for eksempel, vil du ønsker å sammenligne størrelsen på biter av DNA fra to prøver - fra den mistenkte og fra et åsted prøve, kanskje. Hvis du arbeider med plasmider fra bakterier, derimot, kan det hende du må sørge for at plasmidet inneholder innsatsen. Derfor, hvordan du tolker din gel vil blant annet avhenge av eksperimentet du gjorde. Likevel er det noen generelle regler du kan bruke.
Bruksanvisning
1 Starter fra toppen av bildet, måle avstanden til hvert band i "standarder" kjørefelt av gel (aka stigen). Den standarder kjørefelt inneholder DNA-biter hvis størrelse er allerede kjent, så du bør allerede vet størrelsen på hver før begynnelsen av eksperimentet. Også måle avstanden som band i hver av prøve baner.
2 Fordel avstand hver standard og hvert bånd i prøvene som tilbakelegges av avstanden til bunnen av gelen. Resultatet kalles den relative mobilitet. Du kan bruke regnearkprogram til å gjøre det aritmetiske for deg hvis det vil gjøre dette trinnet raskere.
3 Skriv inn den relative mobilitet og størrelsen på hver standard i regnearkprogrammet, og deretter bruke regnearkprogrammet graf verktøy for å lage en graf av disse dataene med relativ mobilitet på x-aksen og størrelse på y.
4 Monter en linje til grafen ved hjelp av lineær regresjon. Rådfør Hjelp seksjon regnearkprogrammet er hvis du trenger å vite hvordan du gjør dette. Du bør ende opp med en ligning, kanskje en som ligner på følgende:
y = (0,3) x ^ -2,5
Legg merke til at x her vil være den relative bevegelighet, mens y er størrelsen. Merk også at ligningen kan ha helt forskjellige tall for eksponenten og koeffisienten - denne ligningen er bare ment som et hypotetisk eksempel.
5 Ta den relative mobilitet for band fra prøven og plugge den inn som x for å beregne størrelsen av DNA-brikker i prøve band.
Anta ligningen avledet av regnearkprogrammet var faktisk y = (0,3) x ^ -2,5, og den relative mobiliteten til en bestemt prøve bandet var 0,68. Erstatte 0.68 inn i ligningen, finner du følgende:
y = (0,3) (0,68) ^ - 2,5
Ved hjelp av kalkulatoren, heve deg 0,68 til -2,5 og finne følgende:
y = (0,3) (2,62)
y = 0,786
som da ville være den beregnede størrelse i kilobaser av DNA i et av de band fra prøven.
plasmider
6 Merk at du kan eller kanskje ikke trenger å bruke instruksjonene i denne delen. Agarosegelelektroforese blir ofte brukt for å bekrefte at et plasmid som inneholder et gitt innsats. Hvis du ikke jobber med plasmider, kan du hoppe over dette avsnittet. Hvis du er, men du kan følge disse instruksjonene.
7 Legg merke til at hvis du arbeider med uklippet eller bretter plasmider, kan du ikke anslå størrelsen ved hjelp av prosedyren fra punkt 1 ovenfor. Det er fordi uklippet og bretter plasmider migrere til forskjellige priser fra lineære DNA.
8 Sammenligne antall band i hvert kjørefelt. Husker at et restriksjonsenzym kutter DNA på steder hvor en gitt sekvens kalt restriksjonssete forekommer. Ved en prøve ble behandlet med to restriksjonsenzymer, bør et bånd for innsatsen, og et bånd for resten av plasmidet begge være til stede. Det er fordi innsatsen vil bli flankert av to restriksjonsseter, hver for en annen enzym, så kutt på begge disse områdene vil frigjøre innsatsen fra plasmidet. Et snitt på bare ett sted, derimot, vil konvertere plasmidet til lineære DNA. Et eksempel kutt uten restriksjonsenzymer eller en begrensning enzym, da bør har et enkelt band, mens en prøve kuttet med to restriksjonsenzymer bør inneholde to band.
9 Se opp for band som er opprettet av bretter plasmid DNA. En nicked plasmid som har et kutt i en enkelt tråd bare, slik at den vandrer langsommere enn et kutt plasmid. Cut plasmider igjen migrere saktere enn uncut DNA.
10 Anslå størrelsen på innsatsen ved hjelp av prosedyren beskrevet i punkt 1 og avgjøre om det passer dine forventninger (som vil variere avhengig av eksperimentet.)