Slik leser proteinelektroforese

Natriumdodecylsulfat-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) er en biokjemisk fremgangsmåte for identifisering av proteiner i oppløsning. Som det fremgår av Mathews et al i "Biochemistry", proteinprøver blir først lastes inn i "brønner" eller hull på den ene ende av polyakrylamidgel blokken. Et elektrisk felt blir så påført gelen. SDS, lagt til de innlastede prøvene, benekter den naturlige ansvaret for proteiner. Av denne grunn, protein molekylvekt alene bestemmer migrering hastigheten av proteiner som de beveger seg gjennom gelen mot den positivt ladede pol, bemerker bitesize Bio. Flere proteiner i den samme prøven vil derfor atskilt fra hverandre og migrere til forskjellige posisjoner.

Bruksanvisning

1 Orientere gel fotografiet. "Top" er plasseringen av brønnene hvor prøvene som opprinnelig ble tilsatt. "Bunn" er hvor prøvene migrerte mot og som oftest inneholder fargestoffet fram som angir den migrerende fronten av prøvene. Enten venstre eller høyre skal inneholde en "markør," brukt som en forutsigbar vekt guide molekylær.

2 Merk prøvene for hvert kjørefelt. Øverst, prøvene tilsatt brønnene vil ha migrert vertikalt i "baner". Derfor er alle stolpene synlige i en vertikal kolonne kom fra en prøve som er lagt rett ovenfor. Bruk linjal og penn til å sette grenser på baner hvis det er vanskelig å visualisere kolonner.

3 Merk de molekylære størrelsen på bandene i markør kjørefelt. Kommersielt tilgjengelige markører komme med et bilde av bandet mønster for å forvente sammen med molekylvekter på hvert bånd. Band er de mørke horizonal "barer", som faktisk er farget protein innebygd i gel.

4 Tegn lette vannrette linjer som strekker seg ut fra hver markør bandet til den motsatte kanten av gelen. Vær forsiktig med å gjøre disse linjene parallelt til brønnene og til fargestoff front. Disse linjene indikerer hvor proteiner med molekylvekt angitt ved hver av de markørbåndene vil være plassert i hver bane. For eksempel vil et bånd i spor 4 som ligger like under den linje som stikker ut fra 25-kilodalton markør bånd antyder at spor 4 båndet er nesten, men ikke helt 25 kD i molekylvekt.

5 Merk hver bandet i hvert kjørefelt med sin forventede molekylvekt. Bruk markører som en guide, og estimatverdier mellom markør størrelser.

6 Nedenfor gelen fotografi, lage en liste over "proteiner" for hvert kjørefelt. Begynn med å si hva som er kjent om hver prøve, for eksempel sin opprinnelse eller forhold. Deretter liste estimert molekylvekt på hvert bånd i kjørefeltet. Baner med en bånd indikerer at prøven inneholder kun ett protein. Baner med flere bånd indikerer tilstedeværelse av flere proteiner. Band som kjører med migrasjon fronten er mindre enn foreslått av den nærmeste markør og sannsynligvis kan ikke forutsies unntatt som "mindre enn" markøren indikerer.

7 I listen proteiner, merke rariteter. En "smurt" utseende kan tyde på at for mange proteiner er til stede, eller at viskositeten av prøven påvirkes sin vandring Dersom bånd synes å gå utenfor kanten av banen, eller er ganske stor sammenlignet med andre band, kan konsentrasjonen av dette protein er sannsynligvis er for høy og bør fortynnes i fremtiden elektroforese. En gråaktig fargetone gjennom hele kjørefelt, mørkere enn bakgrunnen gel farge indikerer utvisket proteinfragmenter.

8 Fastslå identiteten til proteiner i hvert kjørefelt. Selv om dette gjøres kun ved hjelp av molekylvekten, vil kilden for hvert kjørefelt sannsynlig indikerer spor i tillegg. Tenker på at under visse forhold, kan proteiner opprettholde en dimer eller trimer krets på en gel. Derfor kan en protein vises på en gel som tre distinkte bånd. Selv om proteiner ikke kan identifiseres, kan den relative mørke av båndene innebære konsentrasjonene av proteinene i oppløsning. Eventuelle nysgjerrige og ukjente proteiner kan bli isolert direkte fra den opprinnelige gel og sendt for identifikasjon.