Slik tester du Retention Times of HPLC kolonner

Væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) er en metode for instrumentell kjemisk analyse. Den brukes til å finne den kjemiske sammensetningen av ukjente. Prøven, oppløst i et løsningsmiddel (mobil fase), blir pumpet gjennom et rør eller en kolonne, pakket med et porøst fast stoff. Den relative affinitet av kjemikalier i prøven mot kolonnen pakking den vil avgjøre hvor lang tid det tar kjemikalier å passere gjennom kolonnen. Dette er kjent som oppholdstiden for en gitt kjemisk. Retensjonstider er funnet eksperimentelt ved å kjøre en kjent kjemisk forbindelse gjennom kolonnen som testes.

Bruksanvisning

Fastsettelse av oppholdstid

1 Bestem deg betingelsene du vil bruke for å finne den oppholdstid i kolonnen under evaluering. De grunnleggende betingelser vil omfatte type mobilfaseløsningsmiddel, løsningsmiddelstrømningshastighet, detektortype og setting, og den spesifikke kjemiske som vil bli brukt. Disse forholdene kan noen ganger bli funnet i en eksisterende offisielle testmetode.

2 Koble HPLC-kolonnen til en mobilfasepumpe, i spalte innløp til, og til detektoren, i kolonne avslutte.

3 Slå på de forskjellige komponenter i den HPLC: pumpen, detektoren og datafangst datamaskin.

4 Fylle den mobile fase reservoar med et passende oppløsningsmiddel og starte den mobile fasen gjennomstrømning av kolonnen via pumpen.

5 Forbered eller oppnå en standardoppløsning av det kjemiske blir brukt for testen. Ofte slike kalibreringsstandarder kan kjøpes ferdige. Man kan også lage en standardoppløsning ved å oppløse en passende mengde av den kjemiske i mobil fase oppløsningsmiddel. Med mindre du følger en bestemt metode som forteller deg annerledes, starter med en standard konsentrasjon på ca 50 deler per million. Dette kan økes eller reduseres for derved å oppnå en detektorutgangen topp som både er stor nok for integrering og liten nok til å opprettholde en symmetrisk topp form.

6 Injisere en passende mengde av standardløsningen på HPLC. Et volum på 10 mikroliter er typisk. På samme tid starter datainnsamling via datamaskinen.

7 Flg detektorutgangen på datainnsamlings data fra datamaskinen. Når en topp vises på utgang, vente to minutter og så stoppe datainnsamling.

8 Ved hjelp av datainnsamling programvare, integrere detektorutgangen for å identifisere den kjemiske peak. Fra programvaren, les av oppholdstid på som toppen apex er funnet.

Hint

• Retensjonstider for en gitt kjemisk og kolonnen kan endres på grunn av faktorer slik som omgivelsestemperatur, mobil fase strømningshastighet og kolonne aldring. Tilbakeholdelsestider bør kontrolleres på nytt med jevne mellomrom.
• Siden HPLC-programvare som normalt bestemmer oppholdstiden fra det høyeste punktet på detektoren topputgangs for et kjemisk, kan forandringer i toppform (for eksempel på grunn av overbelastning kolonne) gi tilsynelatende endring i retensjonstid.