TOPO Kloning Protokoller
TOPO kloning er en prosess for kloning som benytter generelt, 3 'A-rester som er termodynamisk ustabile og kombinerer dem med en Taq DNA-polymerase. I tillegg er prosessen bruker en frisk polymerasekjedereaksjon produkt (PCR) som må lagres ved 4 grader Celsius. Denne formen for kloning optimaliserer den aktive topoisomerase I-molekylet lagt til på slutten av en lineær vektor. For å utføre TOPO kloning, bør en viss protokoll følges.
Preparat
Noen grunnleggende tiltak kan iverksettes for å fremskynde den samlede TOPO kloning prosessen og bidra til å sikre sin suksess. Først bør rør av levedyktige celler anbragt på is for å opprettholde deres akseptabilitet. Deretter bør den super optimale kultur (SOC) medium, bakterievekst anriket med næringsstoffer, bringes til værelsestemperatur. Den selektive plater bør da forvarmes til 37 grader Celsius slik at de er fullt klar når det gjelder tid til å bruke dem.
kombinere Ingredienser
For å starte kloningsprosessen, en kombinasjon av 2 mikroliter av polymerase kjedereaksjon (PCR) produkt, 0,5 mikroliter saltoppløsning og 0,5 mikroliter av kloningsvektor bør kombineres i et 0,5-ml sentrifugerør. Når kombinert, vil disse ingrediensene må være satt ved romtemperatur og inkubert i fem til ti minutter. Deretter vil den kombinerte ingrediensene legges til "Topp-10 kjemisk kompetente celler" i en 50-mikroliter tube og plassert på is i ytterligere ti minutter. Etter dette, må cellene varmesjokk ved 42 grader Celsius nøyaktig og plassert på is i ett minutt før 180 pl av SOC-medium ble tilsatt. Denne blandingen bør deretter ristet i en horisontal retning ved 200 rpm i ytterligere en time ved 37 grader Celsius.
endelige Steps
En blanding av 50 mikroliter og 100 mikroliter av hver reaksjon bør platet ut "på LB + AMP + X-Gal-plater og inkuberes uten risting over natt ved 37 C." Den neste dag ble tre hvite kolonier fra hver reaksjon bør bli plukket ut og plassert i 4 ml LB + AMP og inkuberes over natten ved en temperatur på 37 grader Celsius, mens det ble ristet ved 200 rpm. det siste trinnet er den mini fremstillingen av plasmidene og venter for å se hvorvidt fremgangsmåten var vellykket.