Typer Kromatografi klargjør Antigen

Et antigen er et molekyl som gjenkjennes og bindes av et antistoff. Hvis du prøver å forberede antigen for et eksperiment, avhengig av hvordan du produsert antigenet og på protokollen, er det flere typer kromatografiske teknikker du kan bruke. Immunoaffinitetskromatografi er den mektigste av disse, men også den dyreste. Størrelse-eksklusjonskromatografi, nikkel-histidin kromatografi og ionebyttekromatografi er muligheter, så vel.

immunoaffinitetskromatografi

Denne teknikken bruker agarosekuler behandlet for å feste antistoffer mot dem; antistoffene er spesifikke for antigenet av interesse. Når perlene er utarbeidet, vil du helle slurry som inneholder perler inn i kolonnen og hell buffer gjennom å vaske ut eventuelle gjenværende konserveringsmidler eller salter; Dette trinnet kalles ekvilibrering av kolonnen. Til slutt, vil du legge prøven inneholder antigen. Bare antigenet vil bindes til antistoffene; de andre komponentene i blandingen vil strømme gjennom kolonnen og kommer ut på den andre enden, eller elueres, som man legger flere buffer. Denne tilnærmingen er meget kraftig, men også meget kostbare, fordi antistoffer som er kostbare å fremstille.

Nikkel-histidin Kromatografi

Hvis du produserer et antigen ved å forvandle e. coli med genet for proteinet, kan man merke proteinet med en 6-histidin-tag for lettere rensing. Denne "tag" er bare en serie av seks etterfølgende aminosyrer stiftet på den ene enden av proteinet. Sammen danner disse histidiner har en meget høy affinitet for metallioner som nikkel og kobolt, slik at antigenet kan renses ved hjelp av kuler som har nitriloacetic syre knyttet til dem. Den NTA binder nikkelioner og 6-histidin koder i sin tur binder nikkel. Kolonnepreparat er lik immunoaffinitetskromatografi.

Size-Exclusion Chromatography

SEC bruker mye lengre kolonner enn affinitetskromatografiske prosedyrer, og disse kolonnene må være forberedt på forhånd, siden perlene trenger tid til å bosette seg. Perlene i en SEC eksperiment er faktisk Sephadex perler som har hull i dem, litt som små svamper. Små proteiner kan arbeide seg inn i disse hullene, mens store proteiner kan ikke, slik at når prøven helles gjennom kolonnen, vil større proteiner elueres før de små. Du kan følge utviklingen av proteiner gjennom kolonnen ved hjelp av sporing fargestoffer, som vil oppføre seg på en lignende måte.

Ionebytterkromatografi

Ettersom pH-verdien i en løsning blir mer grunnleggende, visse aminosyrer i et protein bli deprotonert, eller miste hydrogenioner, slik at deres netto ladning blir mindre positiv (eller mer negativ). På et bestemt pH, vil proteinet har ingen netto kostnad; med andre ord, vil det være nøytral, hverken positivt eller negativt ladet. Denne pH-verdi kalles det isoelektriske punkt, og den varierer for forskjellige proteiner. Ionebytterkromatografi utnytter disse forskjellene for å rense antigen. Prøven innføres i en kolonne med buffer ved en bestemt pH-verdi, og perlene i kolonnen inneholde områder som interagerer med positivt ladede ioner (eller noen ganger områder som interagerer med negativt ladede ioner i stedet). Proteiner og antigener med høyere kostnader vil ta lengre tid å jobbe seg gjennom kolonnen, som gjør det mulig å skille dem.