Ulempene ved Western blotting

Western blotting er en av de vanligste prosedyrer i biokjemiske laboratorier. I utgangspunktet, skiller den proteiner fra en prøve av størrelse, så tester ved anvendelse av antistoffer for å bestemme om et gitt protein som er til stede. Det er nyttig ikke bare i forskning, men også i medisinske eller diagnostiske laboratorier; tester for både HIV og Lyme sykdom, for eksempel, innebære en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) test, etterfulgt av en Western blot hvis ELISA-tester positiv. Til tross for sin popularitet har imidlertid Western blotting flere ulemper.

Nonquantitative

Klassiske Western blot er nonquantitative. Med andre ord, så lenge de kan fortelle forskere om en bestemt protein som er til stede, er de ikke gjør det mulig å kvantifisere hvor mye av proteinet er til stede. Noen bioteknologiske bedrifter nå selger byggesett som gjør at forskere eller lab teknikere for å kvantifisere mengden av protein som finnes ved bruk av en standardkurve - men dette fungerer bare hvis rene prøver av det samme proteinet er tilgjengelig. Videre kan molekylvekten for et protein bare anslås med Western blotting, i stedet bestemmes nøyaktig som med massespektrometri.

antistoffer

Et Western blot kan bare utføres hvis primære antistoffer mot proteinet av interesse er tilgjengelig. Mens antistoffer for mange forskjellige proteiner er tilgjengelige fra bioteknologiselskaper, de er ikke billig; hvis primære antistoffer ikke er tilgjengelige for en gitt protein, vil det ikke være mulig å utføre en Western blot som leter etter det aktuelle protein. Videre kan forskere ønske å bestemme hvorvidt et protein er blitt modifisert på en eller annen måte - hvis den er blitt fosforylert (hadde en fosfatgruppe bundet til det), for eksempel - og med Western blot-teknikk at de trenger antistoffer som er spesifikke for den modifiserte protein.

Opplæring

Det kan være utfordrende å utføre en Western blot skikkelig og få gode resultater, slik at ansatte må være godt trent. I denne som i mye annet, er opplevelsen kanskje den beste veileder; selv for en erfaren tekniker, derimot, er en Western blot tidkrevende. Den gelelektroforese del av forsøket, for eksempel, vil vanligvis ta fra en til to timer for å kjøre. Andre oppgaver kan utføres mens gelen er i gang, selvfølgelig, men forsøket fortsatt tar ganske lang tid å få resultater.

andre Begrensninger

Antistoffer kan noen ganger vise noen off-target bindende, noe som kan gjøre for dårligere resultater. Dessuten, med Western blotting, bruker du et antistoff mot et bestemt protein, så resultatene vil bare fortelle deg om at protein var til stede. Høy-oppløsningsmassespektroskopi, derimot, viser alle proteiner tilstede i en prøve, og i motsetning til klassisk Western blotting det er kvantitativt. Det er viktig å huske på, selvfølgelig, at massespektrometri er mye dyrere og også mer teknisk utfordrende å bruke i forhold til Western blotting.