Ved anvendelsen av buffere i Elektroforese

Elektroforese teknikker separere DNA-molekyler på grunnlag av størrelse; tilsvarende teknikker for proteiner som kan separere proteiner på basis av størrelse eller ladning. I begge tilfeller gelen gjennom hvilken disse molekylene migrerer fremstilles ved anvendelse av en bufret oppløsning, hvor et buffer er en kjemikalie som virker til å stabilisere pH-verdien. Bufferen oppfyller flere viktige roller i elektroforese.

Nåværende

Gelelektroforese virker ved å påføre en elektrisk strøm til buffer-neddykkede gel skive. DNA-molekyler er negativt ladet, og proteinene kan gjøres negativt ladet ved først å denaturere dem, og deretter behandle dem med natriumdodecylsulfat (SDS). De negativt ladede proteiner eller DNA-molekylene beveger seg bort fra den negativt ladet katode og mot den positivt ladede anode. Vann, er imidlertid en meget dårlig bærer av strøm - det eneste bærer strøm effektivt når det er oppløst stoffer i den siden ladede ioner beveger seg i et elektrisk felt. Bufferoppløsningen har en høyere konsentrasjon av ioner (høyere ionestyrke), slik at den kan bære mye mer strøm enn rent vann.

pH Endre

pH-måler hydrogenionekonsentrasjonen. pH-forandring kan endre nettoladningen av molekyler så som proteiner eller DNA, noe som får dem til å migrere saktere (eller hurtigere). Det er fordi disse molekylene har mange grunnleggende områder som kan ta imot hydrogenioner (protoner) og mange sure områder som kan donere protoner. Når en syre donerer et proton, blir det negativt ladede; når en base godtar et proton, derimot, det blir positivt ladet. Som hydrogenionekonsentrasjonen av løsnings øker, proteiner og DNA blir mindre negativt ladet (eller flere positivt ladet). Den pH ved hvilken et molekyl, så som et protein som ikke har noen nettoladning kalles dets isoelektriske punkt. Buffere stabilisere pH i gelen ved et nivå hvor DNA-molekylene vil bli negativt ladet og vil migrere som ønsket.

Stacking Gel

Buffere spille en enda mer komplisert rolle i en form for elektroforese kalt SDS-PAGE, eller natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese. SDS-PAGE er en av de mest vanlige teknikker for analyse av proteiner. Proteiner blir denaturert ved varmebehandling og deretter belagt med natriumdodecylsulfat; neste, blir de lagt til brønnene i gelen, som vanligvis kjøres vertikalt. Gelen har to regioner, stabling gel (øverst) og kjører gel under den. Den stable gel fremstilles med en annen buffer, slik at dens pH er lavere enn det løpende gel; Videre har stablebuffer en lavere ionestyrke. Disse to faktorene gjør at de proteiner for å "stable" eller bli klemt sammen når de passerer gjennom stablings gelen, slik at alle går inn i gelen som kjører på samme tid. Denne virkning bidrar til å sikre den løpende gelen separerer proteinene utelukkende på basis av størrelse.

DNA Gel elektroforese Buffere

De to mest vanlige buffere for gel-elektroforese av DNA er tris-acetat-EDTA og tris-borat-EDTA, hvor EDTA står for etylendiamintetraeddiksyre. EDTA er viktig, fordi det tjener til å chelatere eller "binde" magnesiumioner, å ta dem ut av oppløsningen. Magnesium ioner er viktige kofaktorer for enzymer som kalles DNasene at hogge opp DNA, slik at EDTA i bufferen fungerer som en ekstra forholdsregel for å unngå eventuelle problemer med DNasene.