Hvordan å gjøre en ligeringsreaksjon

DNA-ligering er en kjemisk reaksjon hjulpet av et enzym kalt ligase. Ligase handlinger ved å bli med biter av DNA. Nærmere bestemt skaper ligase en fosfodiester binding mellom ett molekyl av DNA, også kjent som et nukleotid, og en annen nukleotid. I et biologisk system, DNA-ligase reparasjoner og setter sammen DNA-trådene. I laboratoriet kan ligase innsettingen av fremmede DNA-stykker inn i DNA-trådene.

Bruksanvisning

1 Beregne mengden av DNA innskuddet skal brukes. Multiplisere to med antall basepar av DNA innskuddet og deretter med 50 nanogram (ng) av DNA-kjede. Deretter deler av DNA-tråden er antall basepar. For eksempel, hvis DNA-innskuddet har 20 basepar, multiplisere 20 med 2 og deretter med 50 ng for å få 2000 ng. Da, hvis DNA-kjeden som har 100 basepar, fordel ved 2000 ng 100 for å få 20 ng av DNA-innskuddet.

2 Tine 2X ligeringsbuffer ved romtemperatur. Tilsett 50 ng DNA-tråd, 20 ng DNA-innskuddet, 3 mikroliter sterilt vann, 5 ul 2 x ligeringsbuffer, og 3 enheter T4 DNA-ligase til en liten Eppendorf-rør.

3 Kork på Eppendorf-rør og tillate ligeringsreaksjonen forløpe ved romtemperatur i fem minutter.

Hint

• Holde kilde T4 DNA-ligase på is under bruk. Å la ligase for å varme kan ødelegge enzymet. T4 DNA-ligase er den mest brukte ligase i laboratoriet, og er oppkalt etter T4-bakteriofag, et virus som fordøyer bakterier.
• 2X ringsbuffer er en reaksjon løsning som du kan kjøpe fra laboratorie leverandører. Den inneholder kjemikalier som holder pH-verdien i reaksjonen ved et akseptabelt nivå.
• En Eppendorf rør på 1,5 ml plastrør med lokk festet. Det er den mest brukte reaksjonsrøret tilgjengelig.