Hvordan Block i Western Blot
Western blot kan påvise nærvær av spesifikke proteiner i en gitt prøve av vev-ekstrakt ved hjelp av gelelektroforese for å separere proteinene av polypeptidet lengde eller 3D-struktur. Etter at de forskjellige proteiner har blitt adskilt ved gelelektroforese, blir proteinene deretter overført til en membran. Antistoffer, som bindes bare til spesifikke proteiner, blir brukt til å detektere målproteinet.
Innenfor Western blot, reduserer blokkeringstrinn forholdet mellom støy til signalet ved å hindre forekomst av ikke-spesifikk binding.
Bruksanvisning
Klar Blokkering Solution
1 Forut for blokkering av membranen, fremstille nok blokkeringsoppløsningen til fullt ut å dekke membranen når den er plassert i plastbeholderen ved hjelp av en av de følgende kombinasjoner av TBS eller PBS, BSA eller blotto, og Tween eller Triton X-100:
3 til 5 prosent fettfri tørrmelk og 0,05 til 0,1 prosent Tween-20 i PBS eller TBS
Fra 1 til 5 prosent BSA og 0,05 til 0,1 prosent Tween-20 i PBS eller TBS
Bruk TBS som bufferløsning for fosforylerte proteiner.
2 Plasser membran med overførte proteiner inn i plastbeholderen og forsiktig helle den klare for blokkeringsoppløsningen inn i beholderen. Dekk beholder, sikkert
3 Plasser beholderen på en orbital-rystemaskin innstilt på en lav hastighet.
4 Beholderen kan stå ved romtemperatur i 30 minutter til 2 timer, eller den kan oppbevares i kjøleskap ved 4 ° C og hensatt natten over.
Etter blokkering, vil membranen være klar for protein detektering via det primære antistoff.
Hint
- Fordi blokkerer for mer enn 2 timer i romtemperatur kan føre til at membranproteiner som skal utveksles og tapte, sørg for å enten tid eller gjøre oppmerksom på hvor lang blokkering tid ved romtemperatur.
- Dersom sluttproduktet av Western blot avslører en stor mengde av bakgrunnsstøy, endring av bufferoppløsning (fra TBS til PBS eller vice versa) i et andre forsøk kan bidra til å redusere den støy.
- Som membraner som brukes i vestlige blotter pleier å være kreftfremkallende, bruke hansker for å unngå direkte kontakt ved håndtering av membraner.