Hvordan Design en PCR Primer

Ifølge University of Wisconsin BioWeb nettsted, er en PCR-primer som en kort, syntetisk oligonukleotid (vanligvis mellom 18 og 25 baser lang) anvendt for å amplifisere spesifikke områder av DNA i en molekylærbiologisk teknikk kjent som polymerase-kjedereaksjon (PCR). Både en forover og revers primer er nødvendig, som er utformet for å være reverse komplementer av DNA-tråden, for å flanke og binder seg til det ønskede DNA-regionen. Når forskerne ønsker å utføre forskning på et bestemt gen eller region av DNA, må de først til å utføre PCR å skaffe nok av målområdet å jobbe med. Designing primer sekvenser for regionen av interesse kan være nødvendig hvis de ikke allerede er tilgjengelig gjennom tidligere publisert forskning eller av kommersielle midler.

Bruksanvisning

1 Oppnå nukleotidsekvensen av genet eller DNA-region av interesse og bestemme hvor lenge et fragment man ønsker å forsterke. Forover og revers primer er utformet for å binde seg ved begynnelsen og ved slutten av det ønskede fragment. Vanligvis konvensjonelle PCR-metoder bruke primere som flankerer et område mellom 100 til 1000 basepar lange, mens real-time PCR-metoder bruker-fragmenter på 50 til 200 basepar lange.

2 Bestem hvor i den rekkefølgen du vil at primere til å lyve. For eksempel vil du kanskje beliggenheten nær 5 'eller 3' enden av sekvensen eller i midten. Om ønsket, utpeke plasseringen av primerne til å spenne et intron.

3 Følg de anbefalte retningslinjene for primer design. Vellykket amplifikasjon av DNA-produkt avhenger av kvaliteten av primerne og visse variabler er kritisk.

4 Design primere for å være 18 til 24 baser i lengde. Vincent R. PREZIOSO, Ph.D., fra Brinkmann Instruments Inc., tyder på at denne lengden er lang nok til å være meget spesifikke for den ønskede DNA-regionen, men kort nok til å binde (anneal) lett. Primer smeltetemperatur (Tm) bør være mellom 55 til 80 grader Celsius, lav nok til å tillate fullstendig smelting ved eller over 90 grader Celsius, men høy nok til å tillate gløding. GC-innhold (i prosent av Gs og Cs i sekvensen) bør være mellom 40 og 60 prosent. 3'-enden av primeren sekvensen må ende med en C eller G (kalt en GC klemme) for å fremme binding, siden G og C-nukleotidene har sterkere bindinger imidlertid unngå å ha tre eller flere Gs eller Cs i den siste fem baser av sekvensen.

5 Unngå å ha kjøringer av fire eller flere av en base (som ACCCC ...) eller fire eller flere di-nukleotid gjentar (som ATATATAT ...) fordi de kan forårsake mispriming. Design primere uten intra-primer homologi (mer enn tre baser som utfyller innenfor en primer selv) eller inter-primer homologi (der forover og bakover primer har sammenfallende sekvenser). Dette kan føre til selv dimerer eller primer-dimerer, hvor primerne binder seg til seg selv i stedet for binding til den ønskede DNA-sekvens.

6 Bruk Internett-ressurser og nettsteder som bistår i primer design eller hjelpe sjekke primer sekvenser for selv komplementaritet eller potensial til å gjøre sekundære strukturer som hårnåler. Noen primer design nettsteder er Massachusetts Institute of Technology Primer3, National Center for Biotechnology Informations Primer-Blast og Integrerte DNA Technologies 'OligoAnalyzer.