Hvordan skille DNA fra White Blood Cells

Deoksyribonukleinsyre, eller DNA, er funnet i alle deler av en levende organisme. Det påvirker alle aspekter av måten du utvikler, fra fargen på håret til din emosjonelle natur. DNA som er funnet i kjernen av en celle; siden modne røde blodlegemer ikke har noen kjerne, må DNA tas enten fra hvite blodlegemer (leukocytter), eller umodne og kjerneholdige røde blodlegemer. DNA ekstraksjonsmetoder er universelle uavhengig av kilden for materiale - kinn avskraping, vevsbiopsier, eller hår, for eksempel - men noen spesielle fremgangsmåter er nødvendige når man arbeider med blod, på grunn av dens skjøre natur. Følgende protokoll krever forutgående opplæring i grunnleggende laboratorieteknikker, forståelse av forholdsregler og lover knyttet til håndtering av smittsomme biologiske.

Bruksanvisning

1 Isolere leukocytter. Overføre blodet til en V-bunnet sentrifugerør, slik som en 15-ml Falcon-rør. Sentrifuger prøven i 10 minutter ved 300 g eller 1200 opm for å pelletere cellene fra plasmaet. Kast eller fryse plasma dersom dette er nødvendig. Det tynne lag mellom de pelleterte røde blodceller og plasma er det brungule sjiktet, som inneholder hvite blodlegemer, hvorfra DNA blir ekstrahert. Veldig nøye aspirer dette laget og overføre til et nytt rør.

2 Utfør cellelyse for å frigjøre DNA. Resuspender buffy coat i 10 til 20 milliliter forvarmet lyseringsløsning og forsiktig rotere ved 55 grader Celsius i 2 til 3 timer.

3 Rydde opp. Pakk den resulterende lysat 3 til 4 ganger av resuspending det i fenol / kloroform under en kjemisk laminær hette, etter de medfølgende instruksjonene for fenol / kloroform (kan variere for ulike produsenter). Hver gang, samler bare den øvre fase og kast den nedre fase. Følge denne med enten en eter eller kloroform ekstraksjonstrinn. Den endelige forberedelser bør være blottet for enhver hemoglobin.

4 Bunnfall. Under anvendelse av etanol, ekstrahere DNA fra oppløsningen, deretter resuspender pelleten i et egnet volum av TE (dette er vanligvis bedømt ved øyet, avhengig av størrelsen av pelleten, og kan variere fra noen få mikroliter til en fullstendig milliliter). Tilsett 20 mikrogram per milliliter RNAseA i en time for å inaktivere RNaser.

5 Rense. Gjenta fenol / kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling trinn tre ganger til, og resuspender i et endelig volum på opp til 500 mikroliter TE-buffer. Les renheten av dette preparat på et spektrofotometer. Ideelt sett er en aborbance på 260/280 fra 1,6-1,8 ønsket; ellers gjenta trinn 5.

Hint

• Buffy coat sitter meget lett på toppen av de pelleterte røde blodceller og må suges ekstremt langsomt og forsiktig for ikke å forstyrre den røde blodcellefraksjon.
• Umiddelbart DNA på is etter at den er trukket ut for å forebygge nedbrytende.
• Håndtering blod regnes som en svært smittsom prosedyre. Ikke gå videre uten klarering fra lokale politi eller regulatoriske myndigheter. Alltid opprettholde et sterilt miljø og håndtere alle kjemikalier ved hjelp av personlig verneutstyr.