Hvordan Strip en Western Blot

Western blot, eller protein immunoblot, er en prosedyre som detekterer tilstedeværelsen av spesifikke proteiner i en prøve. Overføring av proteiner til en membran etter elektroforese gir mulighet for påvisning av target-proteiner; antistoff-bundne enzymer feste til den enkelte protein, og produserer en farge når de utsettes for et bestemt substrat. Stripping en Western blot-membran fysisk fjerner rester av proteiner og antistoffer.

Bruksanvisning

1 Plasser 10 ml Tween 20, 15 gram glycin og 1 gram natriumdodecylsulfat (SDS) i en 1-liters glasskolbe. Juster pH-verdien til 2,2 ved hjelp av saltsyre, måling ved hjelp av et pH-meter. Tilsett nok ultrarent vann for å bringe det totale volum til 1 liter. Bruk denne bufferen først.

2 Legg den brukte membran i glassfat. Tilsett nok av bufferen fremstilt i det foregående trinn for å dekke membranen. Etter 10 minutter, kast den brukte buffer og tilsett frisk buffer. Igjen, vent 10 minutter og kast den brukte buffer.

3 Hell nok PBS-buffer i glasset fatet for å dekke membranen. Vent i 10 minutter og kast buffer. Hell frisk PBS buffer inn i glassfat og vente ytterligere 10 minutter. Kast den brukte buffer.

4 Hell nok TBST-buffer i glasset fatet for å dekke membranen. Vent i fem minutter og kast den brukte buffer. Hell frisk TBST buffer i glasset fatet. Igjen, vent i fem minutter, og kast den brukte buffer.

5 Teste effektiviteten av fjerningsprosedyren ved å utsette membranen for å antistoffer som skal festes til eventuelle gjenværende proteiner, slik det kreves ved den spesifikke Western blot prosedyre du følger. Expose antistoffer til en indikator løsning. Hvis det ikke er noen reaksjon (indikert ved et fravær av farveforandring), er membranen klar for gjenbruk.

Hint

• Inkuber membranen ved romtemperatur under hele prosedyren.
• Håndter membran med steril tang for å unngå forurensning.
• Kjemikaliene som brukes i denne prosedyren kan forårsake skade. Bruk laboratoriefrakk, vernebriller og hansker hele prosedyren.
• Utføre denne prosedyren i et sterilt miljø, slik som en laminær strømningshette, for å unngå forurensning av membranen.