Slik kalibrerer gelfiltrering kolonner

Gelfiltrering kolonnene blir brukt til å separere proteiner fra komplekse blandinger. Siden hvert protein har en unik molekylvekt, kan de bli indusert til å skille seg i forskjellige lag ved å flytte dem gjennom en filtreringskolonne inneholdende en jevnt fordelt gelmatriks. For å korrekt identifisere hvert protein som er skilt ut, må du kalibrere kolonnene ved hjelp av flere proteiner med kjent molekylvekt.

Bruksanvisning

1 Fjern hetteglass med karboanhydrase, cytokrom C og aprotinin fra kjøleskapet eller fryseren og la dem nå romtemperatur. Tilsett 4 mg av hvert protein til et sentrifugerør per milliliter av gel i filtreringskolonne. Legg 961 mcl av basal salt per milligram protein til hvert sentrifugerør for å oppløse proteinene. Legg 39,2 mcl av ferritin per milliliter av gelen til hvert rør og deretter blande i en sentrifuge.

2 Slå av filtreringskolonne pumpen og lukke stengeventilen ved inngangen til kolonnen. Skru, men ikke fjern, toppen av filtrering kolonnen. Sett pumpen til maksimal strømningshastighet for kolonnen og start pumpen til buffermaterialet har blitt trukket av. Stoppe pumpen.

3 Tilsett 1 ml av hver proteinet til filtreringskolonne ved anvendelse av en pipette pumpe. Dryppe proteinene ned på innsiden av kolonnen fra en høyde på 1 cm til 2 cm, som arbeider rundt den indre kant av kolonnen. Tillat proteinblandingen for å slå seg ned på toppen av gelmatriksen.

4 Plasser utløpsrøret fra pumpen i en ren, tørr 250 ml målesylinder. Start pumpe ved en hastighet på 0,30 ml pr minutt og drives proteinene inn i gelmatriksen. Mens pumpen er i drift, skyll sider av røret ved bruk av pipettes pumpe og en liten mengde av buffervæsken. Når proteinene er helt inn i gelmatriksen, reduseres pumpehastigheten til 0,02 ml per minutt og pumpe i en 5 cm til 7 cm lag av buffervæsken på toppen av matrisen.

5 Koble kolonne cap fra vannkranen. Rens kolonne lokket og innsiden av kolonnen ved hjelp av vitenskapelige rengjøringsservietter. Installer kolonne cap den. Fylle bufferreservoaret med buffervæsken. Fest en sprøyte fat til stoppekranen og åpne den. Bruk sprøyten for å trekke en liten mengde av buffer gjennom slangen og inn i sprøyten. Steng stoppekran og fest den til kolonnen topper. Åpne vannkranen og se etter lekkasjer.

6 Kjør kolonnen ved 0,02 ml per minutt til flere dager, inntil ferritin båndet nærmer seg enden av kolonnen. Samle all filtreringen gel som pumpes ut i den graderte sylinder.