Hvordan bruke Sanger Reagenser

Sanger reagens brukes for å fastslå den sekvens av aminosyrer som utgjør et peptid. Reagenset vil låsen på - eller tag - aminosyren helt i enden av en peptidkjede, også kjent som den N-terminale ende. Peptidet kan deretter brytes opp i stykker (hydrolyserte) og de enkelte aminosyrene undersøkt ved anvendelse av forskjellige kromatografiske fremgangsmåter. Uansett hvilken aminosyre bærer merkelappen er en på slutten. Sanger reagens er også kjent som dinitrofluorbenzen (DNFB). Når den har låst til en aminosyre, er det referert til som et DNP-forbindelse.

Bruksanvisning

1 Vei opp 3 miligrams av peptid på en skala. Plasser den i et sentrifugerør. Tilsett ca 0,3 ml vann, 0,3 ml av Sanger reagens og 0,075 ml av natriumbikarbonat.

2 Tillat sentrifugerøret inkuberes ved romtemperatur i en time. Under inkubasjonen ristes røret forsiktig for å hindre blandingen i å skille seg. Kontroller pH i løsningen hvert 15. minutt med pH-papir. PH-verdien bør holdes over 9. Hvis det begynner å falle, tilsette en liten mengde av natrium-bikarbonat (ca. en dråpe med en Pasteur-pipette).

3 Etter inkuberingen, tilsett 1,5 ml vann og en like stor mengde eter. La løsningen å skille i lag. Man kan ha til å sentrifugere blandingen for å separere den. Fjern eterlaget (den øverste, gule laget) med en pipette og kast den.

4 Juster pH-verdien ned til 1,0 ved langsom tilsetning av saltsyre. Legg en liten bit av syre gangen, rør forsiktig, så sjekk pH med pH-papir. Alt i alt bør den kreve ca. 0,15 ml syre. Hvis pH går under 1,0, legg en liten mengde (ikke mer enn en dråpe) natrium bikarbonat.

5 Tilsett 3 ml eter. Tillat blandingen å skille seg. Nå det øverste laget (den gule, eterlaget) inneholder DNP-forbindelsen. Ved hjelp av en pipette, forsiktig trekke dette laget og overføre den til et rent prøverør. Sett testrøret til side og tillate væsken å fordampe, og etterlater en tørr, gult faststoff.

6 Vask solid med aceton. Legg 0.3 mililiters aceton, rør forsiktig og trekke ut væsken med en pipette. Legg 0,75 mililiters av syre til reagensrør. Din peptid er nå merket og klar til å bli hydrolysert og analysert med kromatografi metode du velger.