Hvordan unngår jeg PCR primer-dimer?

En polymerase kjedereaksjon (PCR) benyttes for å skape millioner av kopier av en deoksyribonukleinsyre (DNA) sekvensen. Denne teknikken brukes i dataanalyse for å gjenskape små mengder DNA som finnes i biologiske prøver ved ĺsteder slik som å ha tilstrekkelige mengder til å analysere for bevis. Det er også mye brukt i molekylær biologi og bioteknologi forskning for å generere store mengder av en prøve for eksperimenter. For å starte replikering prosessen, trenger du korte sekvenser av DNA kalt primere som festes til lengre DNA-sekvensen som skal kopieres. Noen ganger, primerne festes til hverandre i stedet for til mål-DNA-sekvensen, som danner dimerer som hemmer replikasjonsprosessen.

Bruksanvisning

1 Utforme primere slik at de ikke er selvkomplementære til seg selv eller hverandre, særlig ved 3'-enden. Det betyr å unngå sekvenser av nukleotider i en grunning utforming som har en tendens til å hybridisere med andre sekvenser innenfor primer.

2 Hold guanin og cytosin (G + C) konsentrasjoner i primer mellom 40 prosent og 60 prosent. G og C har en større tilbøyelighet til å hybridisere med hverandre, og derved å øke sjansene for dimeriseringen.

3 Bruk en "hot start" polymerase enzym for PCR. En varm start enzym er bare aktiv når temperaturen din reaksjon har vært på 95 grader Celsius i 10 til 12 minutter, i motsetning til en vanlig polymerase som er aktiv ved lavere temperaturer. Den varme start tillater target DNA-sekvensen for å denaturere grundig før enzymet blir aktiv, noe som minsker dannelsen av primer-dimerer som kan oppstå ved lavere temperaturer med en normal polymerase.

4 Gjennomføre testkjøringer for PCR der du varierer konsentrasjonene av dine primere for å finne den laveste konsentrasjonen hvor din reaksjon vil bli vellykket. Lave primer konsentrasjoner redusere sjansen for å få primer-dimer.