Hvordan bruke Restore Western Blot Stripping Buffer 21059
Western blotting er en bioteknologisk teknikk for påvisning av et spesifikt protein i en prøve. Det innebærer separering av proteiner ved størrelse og ladning ved hjelp av en fremgangsmåte som kalles gel-elektroforese; å overføre dem til en PVDF eller nitrocellulosemembran; og legge primære antistoffer. Hvis proteinet av interesse er til stede, antistoffene binder seg til den.
Til slutt legger forskeren sekundære antistoffer som bindes til de primære antistoffer. De secondarty antistoffene bærer et enzym som avgir lys i nærvær av proteinet; mengden av lys som de avgir reflekterer mengden protein i prøven.
Restore er en merkevare av blot stripping buffer som du kan bruke til å fjerne de primære og sekundære antistoffer hvis du trenger å re-sondere prøven.
Bruksanvisning
1 Varm opp flaske Restore Western Blot Stripping Buffer 21059 før det er ved romtemperatur. Leaving flasken ut i flere timer, eller over natten, vil bringe den til romtemperatur. Hvis det er nødvendig, kan du sjekke det med et termometer.
2 Vask blot med vaskebuffer for å fjerne ethvert kjemiluminescerende substrat som er igjen fra den første sondering. Legg nok Restore Western Blot Stripping Buffer til helt våt blot. Produsenten anbefaler 20 milliliter som en passende mengde for en 8-by-10-centimeter blot.
3 Inkuber blot med bufferen ved romtemperatur. Hvis antistoffene du brukte til å sondere blot var høy affinitet, må du kanskje å ruge på blot på litt høyere temperatur på 37 grader Celsius (98,6 grader Fahrenheit) og gi mer tid. Vanligvis, skjønt, bør 5 til 15 minutter være tilstrekkelig til å fjerne både primære og sekundære antistoffer.
4 Legge til den kjemiluminescerende pepperrot peroksidase-substrat til blot og plassere et ark av fotografisk film på membranen. Filmen vil endre fargen der lyset treffer den. Hvis fotografisk film ikke har oppdaget noen lys slippes ut av prøven etter 5 minutter, har du fjernet den sekundære antistoff og dens konjugerte enzymet.
5 Legge til den sekundære antistoff til blot. Vask blot i vaskebuffer og utsetter det igjen til fotografisk film, akkurat som i trinn 4.
Hvis du ikke ser en endring etter 5 minutter, har du fjernet den primære antistoff og kan re-sondere blot å validere tidligere resultater.
Hvis du ikke klarer å fjerne enten den primære eller sekundære antistoff, re-inkuber blot i Fjern Western Blot Stripping Buffer, som beskrevet i trinn 2 og 3. La ytterligere 5 til 15 minutter for å sikre fjerning av både primære og sekundære antistoffer , og deretter gjenta trinn 4 og 5.
Hint
- Det er viktig å inkubere den blot lenge nok til å fjerne alle de primære og sekundære antistoff, men ikke lenge nok til å skade proteinet av interesse. Generelt bør fem til 15 minutter være nok; avhengig av protein du arbeider med, kan det imidlertid være unntak.
- Aldri gjennomføre et eksperiment av denne typen uten å ha riktig sikkerhetsutstyr (f.eks kjemisk beskyttelsesbriller, hansker, frakk) og følge din lab sikkerhetsprotokoller og prosedyrer.