Hvordan virker Molecular Cloning arbeid?

Introduksjon til Kloning

Molekylær kloning er prosessen for fremstilling av kopier av et stykke av genetisk informasjon for videre analyse. Denne prosessen blir utført ved å overføre en del av DNA fra en organisme til et molekyl som kan reprodusere kopier av den overførte DNA. Molekylet oftest brukt til å lage kopier av DNA i molekylær kloning er et stoff som kalles en bakteriell plasmid. Plasmider er uavhengige former for liv som ikke trenger å være i vertsbakterier for å generere DNA-kopier. Molekylær kloning teknikker brukes ofte i laboratoriet og har vært i bruk siden de ble oppdaget på 1970-tallet.

DNA Isolation and Transfer

Før DNA som studeres kan innføres i et plasmid, må det først isoleres, adskilt danne resten av DNA og brutt opp i fragmenter. Det første trinnet i denne fremgangsmåten, isolering av den delen av DNA som skal bli kopiert, blir gjort ved hjelp av en rekke teknikker, den mest vanlige av disse er kalt polymerase kjedereaksjon, eller PCR. PCR-metoden ikke bare isolerer et stykke av DNA, det øker også mengden av DNA tilgjengelig. Denne forsterkede delen av DNA blir så satt inn i et plasmid (eller annen lignende vektor) og behandlet med spesielle enzymer som forbereder den for DNA-replikasjon. Disse enzymene bryter DNA i lineære fragmenter og behandle disse fragmentene til DNA-tråder som bare inneholder DNA av interesse. Det behandlede plasmid er nå klar for overføring.

transfeksjon

Den fremstilte plasmidet blir deretter overført inn i en vertsbakteriecelle gjennom en prosess som kalles transfeksjon. Transfeksjon gjøres oftest ved hjelp av en prosess som kalles elektroporering, selv om det finnes en rekke teknikker som kan utføre transfeksjon. Elektroporering virker ved å øke vertscellene 'permeabilitet ved hjelp av et elektrisk felt for å skape porene i celleveggen. Bakteriene som inneholdt det behandlede plasmidet blir deretter overført til en vekstplate hvor kolonier av cellene dyrkes.

Identifisering og bekreftelse av suksess

Som er involvert i å skape en molekylær klon prosesser er ikke effektiv i det hele tatt. Før overføring til vekstplaten bakteriene er markert på en måte slik at bakterier inneholdende det ønskede DNA kan bli visuelt identifiseres med en farge eller markør, slik at bare de bakterier med den ønskede DNA er i stand til å vokse. Koloniene som utvikler blir deretter testet for å sikre at det ønskede DNA-er til stede. Når DNA-sekvensen blir bekreftet bakterier kan deretter brukes for undersøkende undersøkelser.