Slik tester Neurofibromin aktivitet i en celle
Neurofibromin er et protein som produseres av mange typer celler i kroppen, inkludert nerveceller og Schwann cellene som omgir nervene. Instruksjonene for å gjøre normalt fungerende neurofibromin er gitt av neurofibromin (NF1) genet, som befinner seg på kromosom 17. Neurofibromin er viktig fordi det er en tumor suppressor protein, som forhindrer ukontrollert vekst og deling av celler som forårsaker tumorer så som nevrofibromer og muligens kreft. Neurofibromin gjør dette ved å hemme funksjonen av et annet protein som kalles Ras, som fremmer cellevekst. Derfor kan unormalt fungerende neurofibromin forårsake sykdommer som nevrofibromatose. Evnen til neurofibromin til å utføre sin funksjon kan testes i et laboratorium ved å se på NF1 genet som produserer det, og hvordan proteinet er uttrykt.
Bruksanvisning
1 Utføre laboratoriefremgangssekvensering av NF1 genet for å lete etter mutasjoner. Alle gener har en genetisk sekvens som består av nukleotidbasene A, C, T og G. Genetic sekvensering innebærer å bestemme deres spesifikke sekvens i genet. Den normale sekvensen koder for et normalt fungerende protein. Se etter ulike mutasjoner som slettinger eller innsetting av nukleotider. Disse feil eller mutasjoner i NF1 gensekvensen ofte fører til en forkortet versjon av neurofibromin protein som ikke kan utføre sin vanlige aktivitet av binding til og inhibering av Ras-proteinet.
2 Test neurofibromin proteinaktivitet ved å utføre proteinanalyser som Western blot-analyse eller immunfluorescens. Kontroller at du har de riktige materialer og reagenser til å gjøre det og følger en standard protokoll som har fortrinnsvis vært publisert. Begge disse laboratorieteknikker tillate visualisering av proteinet. Western Blot innebærer frigjøring av proteiner fra cellene, skille proteiner ved sin lengde eller struktur, deretter bruke antistoffer mot protein å farge og visualisere det. Vurdere neurofibromin aktivitet ved å observere hvis proteinet størrelsen eller strukturen er unormal. Det er viktig å merke seg at den tredimensjonale strukturen til proteinet er den viktigste faktor i funksjon, slik at hvis størrelse og form er unormal, vil det ikke fungere skikkelig. Immunfluorescens innebærer tagging proteinet ved hjelp av antistoffer og konjugater som fluoresce under bestemte bølgelengder av lys. Under et mikroskop, se etter det fluorescerende farging for å indikere nærværet av neurofibromin og vurdere karakteristika som kan påvirke dens funksjon, slik som dens plassering i cellen, konsentrasjonen av protein som er tilstede, og hva det kan være i samspill med.
3 Utføre en av en rekke av proteinekspresjon analyser, for eksempel Lowry eller Bradford assay. Protein assay kit er kommersielt tilgjengelige fra en rekke vitenskapelige leverandører og leverer de fleste av de anvendte reagenser og protokoller som kreves. Disse analyser bestemme konsentrasjonen av proteinet i spørsmålet. Å vite konsentrasjonen av neurofibromin i forskjellige typer eller steder inne i cellene kan indikere dets aktivitet eller mangel derav.
Hint
- Utføre disse typer biologiske tester på protein krever høy kompetanse og er normalt utføres av kvalifiserte forskere. De krever presis håndtering og stell for å unngå forurensning og for å få nøyaktige resultater. Hvis tid og ressurser tillater det, er det fordelaktig å alltid gjenta eksperimentell testing for å verifisere resultatene er troverdige.