Teknikker for Protein Purification

Proteiner er store molekyler dannet av kjeder av aminosyrer som foldes inn i tredimensjonale strukturer. Proteiner eller komplekser av proteiner utføre mange av de viktigste oppgaver i cellen, fra å katalysere reaksjoner på strukturelle funksjoner. Biologer har ofte behov for å isolere et bestemt protein for videre studier eller for andre programmer; de bruker en rekke teknikker for å gjøre dette.

SDS-PAGE gel elektroforese

I denne teknikken, blir proteinene først behandlet med en detergent som kalles natriumdodecylsulfat eller SDS, denaturere dem og får dem til å miste sin struktur. De negativt ladede detergentmolekyler danner komplekser med proteiner. Ofte en kjemisk kalt merkaptoetanol tilsatt for å bryte eventuelle disulfidbindinger mellom cysteinrestene i proteinet også. Deretter blir proteinblandingen tilsatt til brønnene i en skive av polyakrylamidgel og et elektrisk felt får dem til å vandre i retning av den positivt ladede anode. Mindre proteiner vil vandre hurtigere mens større proteiner vil migrere saktere, slik at proteiner kan bli separert på basis av deres størrelse eller molekylvekt.

Sedimente Velocity & Equilibrium

En sentrifuge er i det vesentlige en toarmet rotor med et rør på hver ende. En motor roterer rotoren ved svært høye hastigheter, å underkaste innholdet i hvert rør for en kraft mange ganger sterkere enn tyngdekraften. Proteiner i løsningen vil gradvis migrere mot bunnen av røret; noen av dem, men vil gjøre det raskere enn andre. Likevekt sedimente fungerer basert på et lignende prinsipp, men legger til en vri: prøven blir dispergert i en densitet-gradient dannet av en høy konsentrasjon av sukrose eller cesium-klorid. Som sentrifugen roterer, proteiner i prøven gradvis migrere til det sted hvor dens flytedensitet er den samme som i omgivelsene.

kolonnekromatografi

Kolonnekromatografi er en kraftfull teknikk som innebærer å tvinge et blandingen gjennom en kolonne pakket med en porøs grunnmasse av kuler eller små partikler. Løsningsmidlet strøm fra toppen av kolonnen presser blandingen gjennom matriksen, men noen proteiner eller forbindelser i blanding interagere med mer matrisen enn de andre, og derved ta lengre tid å dukke opp. Gjennom denne fremgangsmåte, kan kolonnekromatografi separere en blanding i sine komponenter. Det finnes en rekke forskjellige varianter på den samme grunnleggende idé. Ionebytte-kromatografi, for eksempel, bruker en matrise bestående av perler som er enten positivt eller negativt ladet, slik at proteiner av motsatt ladning blir holdt tilbake i kolonnen. Affinitetskromatografi benytter kuler eller partikler belagt med et molekyl som vil binde seg til et spesifikt protein i blandingen - et antistoff, for eksempel, eller substrat av et enzym (molekylet enzymet virker på). Proteinet av interesse vil forbli i kolonnen mens alle de andre strømme gjennom og kan fjernes senere ved å endre pH eller tilsetning av en konsentrert saltoppløsning.

isoelektrisk fokusering

Isoelektrisk fokusering også innbefatter gelelektroforese, men proteinene ikke er forbehandlet for å denaturere dem. I stedet blir de lagt til en polyakrylamidgel skive der spesielle buffere har blitt brukt til å opprette en pH gradient. Avhengig av deres struktur, forskjellige proteiner har forskjellige isoelektriske punkter, eller pH-verdier ved hvilke de ikke har noen nettoladning. Når et elektrisk felt påtrykkes, vil hvert protein migrerer inntil den når sitt isoelektriske punkt.